成体内源性神经干细胞的MRI活体示踪

摘要

研究背景:
　　 神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的应用为中枢神经系统神经再生和功能重建提供了全新的治疗思路。目前应用NSCs修复中枢神经系统损伤主要有移植外源性干细胞的“替代治疗”策略和激活内源性干细胞的“补充治疗”策略两种。内源性NSCs因具有来源稳定可靠、无伦理道德问题、无免疫排斥反应等多种优势而成为当前的研究热点。MRI是目前理想的干细胞活体示踪分子影像技术。但MRI示踪技术目前主要用于外源性干细胞的活体示踪，对内源性干细胞的示踪鲜有报道。
　　 研究目的:
　　 探讨利用靶向性磁纳米微粒实现成体内源性神经干细胞MRI靶向示踪的可行性及持久性。
　　 材料方法:
　　 1.成体NSCs的分离、培养及鉴定。
　　 健康成年C57BL/6J小鼠，取脑，吹打成单细胞悬液，用抗CD15免疫磁珠分选后，悬浮细胞培养法，对NSCs行Nestin、CD15鉴定及诱导分化后MAP 2、GFAP和O4鉴定。
　　 2.靶向磁珠的弛豫特性及体外试验。
　　 抗CD15微型磁珠行扫描电镜检查，了解其大小、形状等。原子吸收光谱法测定其平均铁含量。MRI扫描测量其T2弛豫时间及弛豫率。抗CD15磁珠与NSCs孵育后，MRI扫描观察细胞信号强度改变，原子吸收法测定细胞平均铁含量，透射电镜及普鲁士蓝染色观察纳米微粒在细胞中的分布。抗CD15磁珠与脑组织切片孵育后，加入相应荧光二抗，荧光显微镜观察了解纳米微粒在脑内的分布。
　　 3.正常小鼠内源性NSCs的MRI活体示踪及病理检查。
　　 29只正常成年C57BL/6J小鼠随机分为三组：靶向组11只，非靶向组9只，单纯抗体组9只。于立体定位仪引导下向侧脑室内分别注射抗CD15磁珠、单纯磁珠及单纯抗体，于注射后1d、3d、7d、10d进行系列小鼠脑部MRI检查，观察各组小鼠脑信号强度改变，并利用正常脑实质信号强度对低信号改变区域的T2*信号强度进行校正，比较各组各时间点上的校正T2*信号强度的差异。
　　 脑室注射后各时间点上各组随机选取一只小鼠，MRI扫描后取脑，制成石蜡切片，分别进行CD15、Nestin双标记的免疫荧光检查，并进行普鲁士蓝染色，与MRI所观察到的改变进行比对，了解MRI靶向示踪的可靠性。
　　 4.统计学分析。
　　 计量资料以均数±标准差((x)±s)表示。体外实验的靶向组、对照组细胞T2弛豫时间之间的比较使用单因素方差分析进行检验。活体实验各组图像上各时间点的校正T2*信号强度之间的比较采用重复测量资料的方差分析比较。统计学分析使用SPSS 16.0软件，检验水准为P＜0.05。
　　 结果:
　　 1.成体NSCs的分离、培养及鉴定。
　　 抗CD15磁珠分选后的细胞悬浮生长，呈神经球形态，免疫荧光鉴定Nestin及CD15阳性，分化后GFAP、MAP 2及O4阳性。
　　 2.靶向磁珠的弛豫特性及体外试验。
　　 抗CD15磁珠粒径平均约73.77±10.11nm左右，铁含量为10.58μmol/ml，T2弛豫率为0.43×106mol-1·s-1。
　　 NSCs与靶向磁珠孵育后，与对照组细胞相比，其在T2WI及T2*WI上信号明显降低，T2时间缩短。靶向组的T2值与对照组间均有明显统计学差异(P＜0.001)。原子吸收光谱检测示平均每个细胞的铁含量为19.279pg；电镜示细胞膜上可见致密的高电子密度的颗粒附着；普鲁士蓝染色见细胞膜蓝染。
　　 荧光显微镜下观察靶向组侧脑室室管膜下区及侧脑室前方可见CD15阳性细胞。
　　 3.正常成年小鼠内源性NSCs的MRI活体示踪。
　　 正常成年小鼠侧脑室内注射抗CD15磁珠后1d，在T2*WI上可见同侧吻侧迁移流(rostral migratory stream，RMS)出现明显低信号，注射后3d，RMS信号仍减低，但信号强度较前稍恢复，注射后7d，RMS的低信号改变进一步恢复，注射后10d，RMS信号已接近正常。非靶向组及单纯抗体组RMS于脑室注射前后均未见类似低信号改变。
　　 注射后1d、3d、7d、10d，靶向组与非靶向组、单纯抗体组间RMST2*校正信号强度的差异均有统计学意义(P值均＜0.01)，靶向组注射后1d、3d、7d、10d与示踪前的差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。非靶向组与单纯抗体组间各时间点上均无统计学差异(P=0.172～1.000)，两组各时间点间的差异亦均无统计学意义(P=0.112～1.000)。
　　 4.活体示踪后的病理检查。
　　 靶向组RMS内可见普鲁士蓝阳性细胞，双标记免疫荧光染色示与普鲁士蓝阳性细胞相对应的区域可见CD15+及Nestin+细胞。
　　 结论:
　　 以CD15为靶点，抗CD15磁纳米颗粒作为MRI分子探针，可实现成体内源性NSCs的靶向MRI活体示踪，显示正常RMS内存在的内源性NSCs，活体示踪时间可持续7天。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照

声明

第1章 引 言

第2章研究目的

第3章材料和方法

第4章结果

第5章讨论

第6章 结论

参考文献

附 图

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