水蛭素对毒瘀损络急性肺损伤小鼠的保护作用及其机制研究

摘要

急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。ALI一般先有激发事件如直接损伤(肺炎，误吸异物、毒物，溺水，肺挫伤)或间接损伤(脓毒症，烧伤，胰腺炎，妇科损伤，大输血)。ALI的精确发生率尚有争论，但仍然是出院患者发病的主要肺内外因素之一。ALI严重威胁人类的健康，影响患者的生存质量，是医学领域的重要研究课题之一。随着络病学理论的不断进展和急性肺损伤病理机制的深入研究，为“毒瘀损络”病机假说提供了现代生物学依据。脓毒症、肺炎、创伤、休克为ALI发病的四大主要因素，其实质是中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophil，PMN)等炎症细胞及其释放的炎症递质介导的失控的炎性反应，从而引起肺血管内皮损伤、通透性增加和微血栓形成。失控的炎症反应是ALI的基本病理生理机制。中性粒细胞是ALI发病过程中的重要的效应细胞，也是其最终执行者。大量中性粒细胞肺内募集(recruitment)、扣押(sequestration)、迁移(transmigration)和浸润(infiltration)的聚集过程是ALI的病理组织学特征。目前认为，过度、失控的炎症反应是各种病因所致急性肺损伤的根本原因，其中绝大部分表现为PMN依赖性，PMN聚集和激活是引起肺部毛细血管和肺泡损害的主要原因。而在血管活性因子(LPS、凝血酶、TNF-α等)的作用下，肺血管内皮细胞的损伤，血管内皮屏障通透性的升高，是PMN等炎症细胞从血液到达血管外肺组织，在肺组织触发炎症级联反应的关键环节。可见，络脉受损、“开门揖盗”是ALI/ARDS发病的必要前提。ALI动物实验和细胞实验都提示，Rho/ROCK(Rho kinase)途径和MLCK(myosinlight chain kinases)途径对于PMN肺内聚集时的重要性，主要体现在促进血管内皮屏障通透性增高和PMN跨血管内皮浸润。
　　 水蛭应用于中医临床已有两千多年的历史，具有广泛的药理作用和医疗用途，用于破血通经，逐瘀消癥。水蛭素为其主要有效药用成分；研究证明水蛭素(hirudin)是目前已知的作用最强的特异性凝血酶抑制剂；水蛭素对各种血栓病均有效，对静脉血栓和弥散性血管内凝血(DIC)的疗效更佳，并且提示水蛭素可能具有治疗ALI的作用，但具体机制仍未清楚，值得我们进一步的深入探讨。本研究在参考众多文献资料的基础上，采用气道吸入LPS建立小鼠急性肺损伤模型，模型建立前30分钟，以肝素(heparin)为对照药，以“化瘀通络”为指导思想使用水蛭素防治急性肺损伤，观察高、中、低剂量水蛭素在气道吸入LPS后16h的保护作用及其机制。
　　 目的：①探讨Rho/ROCK途径和MLCK途径在ALI及其血管内皮屏障损伤发生发展中的作用;②阐释中医络病学理论及肺络病理生理与ALI发病之间的关系，揭示“毒瘀损络”ALI病机假说的现代生物学基础；③探讨“化瘀通络”治疗早期ALI的可行性及科学性；④阐明水蛭素治疗LPS致ALI的病理生理学和细胞分子学作用机制，为临床防治ALI提供实验依据。
　　 方法：⑴基于中医络病学理论与ALI发病之间的关系及“毒瘀损络”ALI病机假说，从理论上探讨“化瘀通络”防治早期ALI的科学性和可行性，为应用水蛭素治疗ALI提供理论依据。⑵利用随机数字表将小鼠分为5组，每组6只：①正常对照组(A组)；②LPS致肺损伤组(B组)；③LPS+Hirudin高剂量组(C1组)；④LPS+Hirudin中剂量组(C2组)；(5)LPS+Hirudin低剂量组(C3组)。B、C1、C2、C3组小鼠ALI模型制备同前，A组滴入生理盐水，余组滴入LPS。LPS滴入前30min，LPS组腹腔注射0.5mL的生理盐水；C1组腹腔注射等容积2000ATU的Hirudin溶液；C2组注射等容积1000ATU的Hirudin溶液；C3组注射等容积500ATU的Hirudin溶液。通过RT-PCR法测定肺组织ROCKⅡ mRNA和MLCK mRNA的表达来探讨水蛭素防治LPS致急性肺损伤的细胞分子学作用机制。
　　 结果：
　　 ⑴经过细致的理论探讨和研究，认为急性肺损伤属于中医“络病”范畴，并形成了ALI/ARDS“毒瘀损络”的病机假说。本假说认为，毒邪煎熬血液，血凝成瘀；毒邪伤络，血溢成瘀；毒邪伤津耗阴，阴伤血滞为瘀；毒壅气机，血脉凝滞；毒瘀损脏，血行失司；因此毒瘀互化、肺络损伤是ALI/ARDS病机的关键。在治疗上宜遵“络以通为用”的治疗原则，采用以通络为主的“化瘀通络”治法。
　　 ⑵小鼠症状一体征变化滴入LPS后30分钟起，所有小鼠均出现皮毛枯槁、倒立、无光泽；精神不振，行动迟缓，对刺激反应差；恶寒、蜷缩成团状；大便干结；呼吸急促、呛咳。多数小鼠出现紫绀，鼻腔溢出泡沫样液体。各用药组症状有明显改善。
　　 ⑶小鼠呼吸频率B组小鼠呼吸频率为(375±23)次/分钟，与A组(234±11)次/分钟相比，显著上升(P＜0.01)；C1、C2及D组小鼠呼吸频率为(288±13)次/分钟、(290±12)次/分钟、(302±14)次/分钟，与B组相比，显著降低(P＜0.01)，但仍高于A组(P＜0.01);C3组小鼠呼吸频率为(345±23)次/分钟，与B组比较，差异无显著性(P＞0.05)。
　　 ⑷小鼠肺湿/干重比B组小鼠肺湿/干重比为(5.39±0.20)，与A组(3.36±0.11)相比，显著上升(P＜0.01)；C1、C2及D组小鼠肺湿/干重比为(4.15±0.16)、(4.54±0.15)、(4.49±0.15)，与B组相比，显著降低(P＜0.01)，但仍高于A组(P＜0.01)；C3组小鼠肺湿/干重比为(5.21±0.21)，与B组比较，差异无显著性(P＞o.05)。
　　 ⑸肺组织病理学检查和肺损伤积分光镜下(×200倍)观察发现：A组小鼠肺组织，肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡壁及间质内无炎症细胞浸润；B组肺组织高度水肿、出血严重，肺间质增宽，肺间质及肺泡腔内可见大量红细胞，肺泡萎陷明显，各种炎细胞大量浸润，部分肺泡完整性被破坏；C1组肺组织轻度水肿，少量炎细胞浸润，肺间质增厚减轻，肺泡萎陷明显减轻，肺泡结构较完整；C2组肺组织轻度水肿，见炎细胞浸润，肺泡结构基本完整，较B组肺受损程度减轻；C3组肺组织严重水肿，肺间质增宽，肺泡腔及间质内可见大量红细胞，肺泡结构欠完整，且有明显炎细胞浸润；D组肺组织稍有水肿，肺泡腔及间质仅见少量红细胞及炎细胞浸润，肺泡结构较完整。B组小鼠肺损伤积分为(13.33±0.82)，与A组(1.50±0.84)相比，显著上升(P＜0.01)；C1、C2、C3及D组小鼠肺损伤积分为(6.17±0.75)、(7.50±1.05)、(8.1711.60)、(7.17±0.75)，与B组相比，显著降低(P＜0.01)，但仍高于A组(P＜0.01)。
　　 ⑹小鼠肺组织MPO B组小鼠肺组织MPO为(5.02±0.68)U/g，与A组(2.00±0.32)U/g相比，显著上升(P＜0.01)；C1、C2及D组肺组织MPO为(2.95±0.38)U/g、(3.09±0.37)U/g、(3.12±0.37)U/g，与B组相比，显著降低(P＜0.01)，但仍高于A组(P＜0.01)；C3组小鼠肺组织MPO为(1.15±0.59)U/g，与B组比较，差异无显著性(P＞0.05)。
　　 ⑺小鼠BALF中PMN含量B组小鼠BALF中PMN含量为(59.5±10.9)％，与A组(10.83±2.6)％相比，显著升高(P＜0.01)；C1、C2及D组PMN含量为(41.5±8.46)％、(43.8±8.52)％、(42.8±7.62)％，与B组相比，显著降低(P＜0.05)，但仍高于A组(P＜0.01)；C3组小鼠PMN含量为(51.3±10.1)％，与B组比较，差异无显著性(P＞0.05)。
　　 ⑻小鼠肺组织ROCKⅡ mRNA的表达相对A组小鼠肺组织ROCKⅡmRNA表达(相对单位relative unit)，B组与A组相比，显著上升(P＜0.01)；C1、C2及C3组与B组相比，显著降低(P＜0.01)，但仍高于A组(P＜0.01)。
　　 ⑼小鼠肺组织MLCK mRNA的表达相对A组小鼠肺组织MLCK mRNA表达(相对单位relative unit)，B组与A组相比，显著上升(P＜0.05)；C1与B组相比，显著降低(P＜0.05)，但仍高于A组(P＜0.05)；C2及C3组与B组相比，差异无显著性(P＞0.05)。
　　 结论：LPS诱导的小鼠ALI可激活Rho/ROCK途径和MLCK途径，引起肺血管内皮细胞骨架的损伤，血管内皮屏障通透性增高，PMN等炎症介质聚集肺内造成炎症损伤和肺功能改变；而水蛭素可通过抑制Rho/ROCK途径和MLCK途径，促进MLC去磷酸化、缓解张力，从而保护内皮细胞屏障和防止炎症损伤。本研究为水蛭素保护内毒素ALI的药效学及其机制研究提供了初步的实验依据；也是在络病学理论指导下，对于“毒瘀损络”ALI采用以通络为主的“化瘀通络”治法及其机制的有益探索。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

上篇　文献综述　内皮细胞骨架在血管内皮通透性调节中的作用

1内皮细胞骨架的结构

2血管内皮通透性与细胞骨架的关系

3 Rho／Rho激酶信号通路对调节血管内皮通透性的影响

4 Rho／Rho激酶信号通路介导肌动蛋白细胞骨架改变EC通透性

5 Rho激酶抑制剂的保护作用

6展望

参考文献

中篇　理论研究　络病理论基本内涵与ALI／ARDS发病的关系

1络病理论的形成渊源

2络脉的基本特征

3络病的内涵

4肺络的生理特点和功能

5肺络病证

6急性肺损伤的中医发病机制研究

7 ALI／ARDS的络病机制—“毒瘀损络”病机假说

8结语

参考文献

下篇　实验研究

前言

第一部分水蛭素对脂多糖急性肺损伤的保护作用及病理生理学机制研究

实验一水蛭素对脂多糖急性肺损伤的保护作用

实验二水蛭素对脂多糖急性肺损伤中性拉细胞肺内聚集的抑制作用

第二部分水蛭素对脂多糖急性肺损伤保护作用的细胞分子机制研究

实验 水蛭素对脂多糖急性肺损伤小鼠肺组织ROCK Ⅱ mRNA和MLCK mRNA表达的影响

参考文献

结论

创新点

有待进一步探讨的问题

攻读博士学位期间所取得的成绩

致谢