骨髓基质干细胞复合去细胞神经修复大鼠坐骨神经缺损及其机制的初步研究

摘要

背景和目的:
　　 外伤导致的周围神经缺损是临床常见的致残性疾病，要恢复神经功能就必须先恢复神经的连续性。目前，自体神经移植是修复神经缺损的主要方法，但存在来源有限、规格难以匹配以及供区功能丧失等客观问题。同种异体或异种神经是很理想的神经移植材料来源，但直接植入修复必然引起受体强烈的免疫排斥反应，导致治疗失败。组织工程化周围神经的研制为周围神经缺损的修复带来了新的希望，其研究内容主要是：模拟正常神经的构造，将具有促进周围神经再生的种子细胞种植于天然或人工合成的支架材料中，用于桥接长段的神经缺损。
　　 骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是存在于骨髓中的一种具有多向分化潜能的干细胞，易于体外进行分离、提纯和大量的扩增。许多研究表明BMSCs在体外可以诱导分化为类许旺细胞，植入体内能促进周围神经再生，近来部分学者还证明其在体内周围神经再生微环境下也能分化为类许旺细胞而发挥作用，但具体相关机制仍未研究清楚。
　　 本实验将体外分离培养的同种异体大鼠BMSCs与去细胞同种异体神经支架复合，移植入大鼠坐骨神经缺损处，观察其功能恢复及坐骨神经再生的情况，检测植入的BMSCs在体内存活、分化、分泌神经营养因子的情况，以及前角运动神经元和背根神经节感觉神经元存活情况，初步探索阐明BMSCs促进大鼠坐骨神经再生的可能机制。
　　 方法:
　　 1.PKH26标记结合DAPI复染的方法在组织工程神经种子细胞体内示踪中的应用研究。
　　 1.1 大鼠BMSCs的体外培养及流式检测。
　　 取体重为100g左右的雄性Wistar大鼠6只，无菌条件下切取双侧股骨和胫骨，用5mL无菌注射器及DMEM培养基冲洗髓腔获得细胞悬液，用全骨髓贴壁培养的方法分离、培养原代BMSCs。行传代培养至第3代，用胰酶消化收集细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志CD29、CD44的表达及细胞周期情况。
　　 1.2 PKH26标记BMSCs及细胞生物活性的检测。
　　 用PKH26荧光染料进行标记，荧光显微镜下观察标记效果，流式细胞仪检测荧光标记率，MTT法测定细胞的活性，体外成脂和成骨诱导鉴定细胞的分化能力，并与未标记细胞进行比较。
　　 1.3 BMSCs复合去细胞神经支架在体外示踪实验。
　　 取Wistar大鼠坐骨神经24条，剥除神经周围结缔组织，依次用蒸馏水、3％TritonX-100和4％脱氧胆酸钠处理去除细胞，抽样进行HE染色检测。在手术显微镜下，用10ul的微量进样器将PKH26标记好的BMSCs(浓度为107个/ml)细胞悬液注射到去细胞神经支架内，构建成组织工程神经，置入含完全培养基的培养皿内，于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养。
　　 分别于3d、5d、7d、14d各取3份样本，行冰冻切片，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察在体外培养的环境下BMSCs在支架内存活、迁移的情况。
　　 1.4 大鼠骨髓间充质干细胞体内植入示踪实验。
　　 取体重为200g左右的雌性Wistar大鼠12只，10％水合氯醛(0.03ml/kg体重)腹腔内注射麻醉，暴露一侧坐骨神经并切除一段，造成15mm长的神经缺损，然后用构建好的组织工程神经移植修复。分别于术后1周、4周、6周、8周各取3只大鼠，取出植入组织工程神经，行冰冻切片，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察BMSCs在体内存活的情况。
　　 2.骨髓基质干细胞复合去细胞神经修复大鼠坐骨神经缺损及其机制的初步研究。
　　 2.1 大鼠BMSCs的体外培养及PKH26标记。
　　 取体重为100g左右的雄性Wistar大鼠9只，用全骨髓贴壁的方法进行BMSCs原代培养，待细胞生长融合达90％即行1∶3传代培养，每只大鼠各取一份细胞标本，用胰酶分别消化收集第1代、第3代、和第6代的BMSCs于EP管中，行荧光定量RT-PCR测定NGF-mRNA和GDNF-mRNA表达。取第3代BMSCs，用荧光染料PKH26行体外标记。
　　 2.2 同种异体去细胞神经支架制备及组织工程神经的体外构建。
　　 取体重为250-300g的雌性Wistar大鼠30只，无菌条件下取双侧坐骨神经约2.5cm长，剥除神经周围结缔组织，依次用蒸馏水、3％TritonX-100和4％脱氧胆酸钠处理去除细胞。在手术显微镜下，用10ul的微量进样器将准备好的第3代的BMSCs(浓度为107/ml)细胞悬液注射到支架内，置入含完全培养基的培养皿内，于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养3天备用。
　　 2.3 大鼠BMSCs复合去细胞神经支架的体内植入实验。
　　 取体重为200g左右的雌性Wistar大鼠50只，随机分为3组，A组为BMSCs+去细胞神经支架组(BMSCs-laden组)共20只，B组为自体神经组(autograft组)共15只，C组为去细胞神经支架组(non-cell-laden组)共15只。10％水合氯醛腹腔麻醉，暴露左侧坐骨神经，切断神经造成约15mm长的缺损，分别用以上三种神经移植物桥接缺损。
　　 2.4 术后大鼠坐骨神经功能恢复检测。
　　 在术前及术后2、4、6周进行实验动物的步态分析，计算坐骨神经功能指数，绘制曲线图。术后6周检测神经移植体动作电位的刺激阈强度和最大振幅并计算传导速度。取双侧腓肠肌，称取湿重，计算湿重比，行石蜡包埋切片，Masson染色比较肌肉纤维和胶原纤维比例。
　　 2.5 大鼠坐骨神经再生组织学检测。
　　 术后6周，取神经移植体中段的组织学切片进行透射电镜观察、甲苯胺蓝染色并作图象分析，测量神经组织百分比、有髓神经纤维密度、轴突直径和髓鞘厚度。另外，用组织免疫荧光方法检测神经丝蛋白(NF)和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。
　　 2.6 检测BMSCs在体内存活和向许旺细胞分化的情况。
　　 术后6周取出神经移植物，行冰冻切片，用DAPI复染细胞核，在荧光显微镜下观察有无PKH26标记的细胞存活，同时行S-100、GFAP组织免疫荧光检测干细胞向许旺细胞分化的情况。
　　 2.7 检测神经移植体内SRY-DNA及NGF-mRNA和GDNF-mRNA。
　　 取新鲜神经移植体，提取总DNA和RNA，行实时荧光定量PCR检测SRY-DNA的表达；行实时荧光定量RT-PCR检测NGF-mRNA和GDNF-mRNA的表达。
　　 2.8 L4、L5段脊髓及背根神经节组织学检测。
　　 取L4、L5段脊髓及背根神经节，用焦油紫行尼氏体染色，测量比较各组间运动神经元和感觉神经元的平均数量、直径和面积。
　　 结论:
　　 1.PKH26荧光染料能有效地标记BMSCs，结合DAPI复染的方法，可用于组织工程神经种子细胞体内示踪的研究。
　　 2.骨髓基质干细胞复合去细胞神经支架植入体内后，在周围神经再生微环境下能存活6周，并能分化为类许旺细胞。
　　 3.体外培养的骨髓基质干细胞能够表达一定量的NGF-mRNA和GDNF-mRNA，复合同种异体去细胞神经植入体内6周后能存活，并且促进神经移植体内NGF-mRNA和GDNF-mRNA的表达。
　　 4.骨髓基质干细胞复合去细胞神经能促进大鼠坐骨神经的再生及功能的恢复，其机制是通过在体内再生微环境下分化为类许旺细胞，促进局部NGF和GDNF的分泌，以及减少运动神经元和感觉神经元的死亡。

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文摘

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论文说明：英文缩写词表

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前言

第一部分PKH26标记结合DAPI复染的方法在组织工程神经种子细胞体内示踪中的应用研究

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分骨髓基质干细胞复合去细胞神经修复大鼠坐骨神经缺损及其机制的初步研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

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