高表达MMP9对大鼠皮肤成纤维细胞生物学行为的影响及TIMP1作用的初步探讨

摘要

背景：糖尿病足是指与下肢远端神经异常和不同程度的周围血管病变相关的足部感染、溃疡和(或)深层组织破坏。由于糖尿病足发病率高、治疗费用贵、伤口难以愈合且容易复发,其发病机制和治疗方法一直是基础与临床研究的重点和热点。近年来国内外研究发现,基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9,MMP9)与糖尿病足溃疡之间关系密切。Muller等人发现,糖尿病足患者溃疡渗出液中MMP9水平较正常人升高。本课题组的前期研究也发现：①糖尿病大鼠皮肤组织尚未受创时,就已经出现皮肤“隐性损害”,而且与高水平的MMP9关系密切；②与非糖尿病大鼠相比,糖尿病大鼠皮肤伤口愈合过程MMP9的水平明显升高。目前普遍认为,高水平的MMP9主要是通过过度降解细胞外基质、生长因子、生长因子受体、整合素及其受体,以及加重伤口局部炎症反应等方面来减慢糖尿病足溃疡的愈合。对于MMP9是否还可以通过影响皮肤成纤维细胞的生物学行为来影响伤口愈合,目前国内外未见相关文献报道。皮肤成纤维细胞是伤口修复的重要效应细胞,任何能够影响其生物学特性的因素最终都将会影响到伤口的愈合。为探讨MMP9在糖尿病足伤口愈合中可能的新机制,本课题选择大鼠皮肤成纤维细胞为研究对象,体外给予不同浓度的糖和同型半胱氨酸刺激,制备高分泌MMP9细胞模型,探讨高分泌MMP9情况下皮肤成纤维细胞生物学行为的变化,同时观察通过组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)抑制MMP9的活性能否改善成纤维细胞的生物学行为。本课题的研究将为探讨糖尿病皮肤伤口的难愈机制提供实验依据,也将为寻找糖尿病足的治疗方法提供新的思路。
　　 目的：⑴建立体外高表达MMP9皮肤成纤维细胞模型,为后续的研究奠定基础。⑵观察高表达MMP9皮肤成纤维细胞的生物学行为和TIMP1的干预效果,以探讨MMP9对大鼠皮肤成纤维细胞生物学行为的影响。
　　 方法：①分别用正糖(5.5 mmol/L)、高糖(22.0mmol/L)和高糖(22.0mmol/L)+高同型半胱氨酸(100μmol/L)培养大鼠皮肤成纤维细胞,检测各组细胞MMP9mRNA(Realtime RT-PCR法)和蛋白(ELISA法)表达量,以及MMP9蛋白的活性(明胶酶谱法),筛选出MMP9表达量及活性最高的组作为模型组进行后续实验。②采用流式细胞术检测细胞增殖功能；CCK-8检测细胞活力；ELISA法检测细胞胶原(羟脯氨酸)分泌能力；划痕实验评价细胞横向迁移能力；Transwell法评价细胞纵向迁移能力。
　　 结果：⑴高糖+高同型半胱氨酸组MMP9 mRNA的表达量(7.05±1.02),蛋白的表达量(206.9±33.6)pg/ml以及MMP9蛋白活性(1.47±0.13)均明显高于正糖组[分别为(1.00±0.00)、(40.4±5.9)pg/ml、(0.57±0.12)]和高糖组[分别为(2.83±0.91)、(73.7±5.8)pg/ml、(0.92±0.11)](P均<0.01),故选择高糖+高同型半胱氨酸组作为高表达MMP9皮肤成纤维细胞模型进行后续实验。⑵高糖+高同型半胱氨酸组大鼠皮肤成纤维细胞S期的比例(6.54±0.29)％、增殖指数(11.3±0.6)％、细胞活力(1.35±0.12)、胶原(羟脯氨酸)分泌量(352.8±60.6)pg/ml、6h横向迁移率(21.3±2.1)％和纵向迁移细胞数(71.2±3.8)均较正糖组明显减少(P均<0.01)。⑶TIMP1干预后,大鼠皮肤成纤维细胞MMP9 mRNA(6.84±1.18)和蛋白(202.4±26.9)pg/ml的表达量与非干预组[分别为(7.05±1.02)和(206.9±33.6)pg/ml]比较差异无统计学意义(P>0.05)。MMP9蛋白活性(0.43±0.13)却较非干预组(1.47±0.13)明显降低(P<0.01)。TIMP1干预后,大鼠皮肤成纤维细胞S期的比例(7.75±0.27)％、增殖指数(12.5±0.5)％、细胞活力(1.64±0.14)、胶原(羟脯氨酸)分泌量(828.6±58.9)pg/ml、6h横向迁移率(31.5±2.7)％和纵向迁移细胞数(85.3±3.7)均较非干预组增加(P<0.05或P<0.01)。
　　 结论：①高糖+高同型半胱氨酸联合培养,可成功建立体外高表达MMP9皮肤成纤维细胞模型。②高表达MMP9皮肤成纤维细胞增殖减慢、活力下降、迁移和胶原分泌能力降低,提示MMP9可影响成纤维细胞的生物学行为。③外源性TIMP1作用下,高表达MMP9皮肤成纤维细胞生物学行为明显改善,提示抑制MMP9的活性有可能改善糖尿病足的伤口愈合。

目录

文摘

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材料方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

附录1 在读期间发表的论文

附录2 英文缩略词表

致谢