华南地区水禽中H5N1流感病毒基因型进化分析

摘要

背景与目的：
　　1997年,H5N1亚型禽流感首次在香港爆发,家禽死亡率高达75％-100%。令人关注的是,这次禽流感的爆发不仅影响家禽,更导致了18例临床感染,其中6例死亡,这是首次禽类流感病毒直接感染人类事件。此后,在2001及2002年,香港地区又有两次高致病性H5N1亚型感染禽类导致家禽死亡的报道。2003年初,香港两名患者确诊为H5N1病毒感染,1人死亡。2003年末至2004年初,H5N1流感病毒肆虐东南亚。这次爆发流行波及9个国家和地区,更有多人感染甚至死亡,其影响面之大为近二十年来所未见。H5N1是否会成为下一次流行性感冒的世界性流行株成为人们关注的焦点。追溯以往三次感染人类的流感大流行,华南地区都是其中不可或缺的一环,许多从事流感病毒研究的科学家认为:华南地区在流感病毒进化演变过程中扮演着重要的角色。此外,香港禽鸟市场上供应的家禽大部分也来自于华南地区,因此,对华南地区的H5N1亚型流感病毒进化进行研究有助于揭示高致病性H5N1的形成及其演变趋势,对该亚型流感病毒爆发进行预测并为疫苗的研制提供支持。自从1997年,香港采取屠宰所有家禽的措施以防止疫情进一步蔓延后,与引起爆发的H5N1(A/Hong Kong/156/97)相同基因组合的病毒未再在香港重现。事件至今已经7年,在华南地区,H5N1发生了怎样的变化?通过在天然基因储存库——水禽中的自由基因组合,产生了哪些新的基因型?这些基因型与A/Hong Kong/156/97是否相同?对人类有没有危险性?各种基因型的流行情况如何?以上种种问题尚待解答。对华南地区水禽中的H5N1流感病毒进行分析将有助于了解我国流感病毒进化的现状,为流感流行的预测打下基础。
　　材料和方法:
　　在华南地区四个监测点(云南大理、湖南洞庭湖、江西鄱阳湖、广东汕头)采集的标本常规处理后,接种于9-11日龄鸡胚尿囊腔,35℃恒温培养72小时,收取鸡胚尿囊液。血凝阳性(AD≥16)且细菌培养阴性标本进一步做血凝抑制试验(Hemagglutinin Inhibition Test,HI实验)和神经氨酸酶抑制试验(Neuraminidase Inhibition Test,NI实验)以鉴定亚型,标本保存于-70℃冰箱。从中选取27株H5N1病毒代表株进行下一步的分子生物学工作。用Qiagen的RNeasy RNA试剂盒提取病毒RNA后,逆转录合成cDNA。以之为模板,用针对不同基因片段设计的特异性引物,进行PCR反应扩增。以PCR纯化试剂盒纯化PCR产物,然后进行测序反应。测序在在DNA测序仪(ABI377)上进行。用GCG10.2编辑和处理基因序列。用PAUP4.1进行进化树分析。在Mega2.1和Bioedit5.0.9上进行序列比较和同源性分析。
　　结果:
　　1、华南地区水禽中存在多种亚型流感病毒,包括H5N1;冬春季是H5N1亚型流感病毒流行高峰期;近两年来,H5N1的分离率呈急剧上升趋势。
　　2、抗原学分析结果表明,根据标本采集时间及基因型的不同,与单克隆抗体反应时,华南地区H5N1的抗原性可分为高反应组和低反应组;目前流行的优势基因型(Z型)的抗原性与以往病毒株相比发生了很大的改变。
　　3、进化树分析表明,目前华南地区的H5N1流感病毒的HA基因仍来源于A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)(简称Gs/GD),属欧亚系列;这些H5N1在水禽中与多种亚型流感病毒进行基因重配,形成多种基因型,其中Z型自2002年末开始稳定下来并占主导地位。
　　4、基因分析表明,Dk/ST/195/01的8个基因都与Gs/GD高度同源,很可能是它的后裔。此外,由于它的NA柄部(stalk region)有20个氨基酸的缺失,根据这一发现可重新探讨HK/156/97(简称H5N1/97样病毒)基因型的形成。
　　5、基因突变分析显示:M基因在各基因型的进化中发挥一定作用。在M2氨基酸序列上,S64A和E66A的氨基酸突变使得该基因获得对环境的适应性。
　　结论:
　　1、H5N1流感病毒在华南地区水禽中长期广泛存在并与多种其它亚型流感病毒共存,这种适宜的外环境为H5N1的进一步发展、进化提供了条件;
　　2、目前在华南地区流行的H5N1病毒,其HA基因仍来自于A/Goose/GuangDong/1/96,从近期爆发记录来看,这些Gs/GD样H5N1很可能仍是未来几年内威胁家禽的主要亚型,甚至有可能通过进一步进化而获得感染人的能力,从而导致流感大爆发;
　　3、自2002年11月起,H5N1各种基因型中的Z基因型开始在水禽中稳定下来并占主导地位,由于它的抗原性发生了较大的变化,现有的疫苗将不能提供保护作用;
　　4、A/HongKong/156/97病毒的NA基因可能来自于类似Dk/ST/195/01的病毒,这类病毒是Gs/GD样病毒的后裔,但NA基因上有19个氨基酸的缺失;
　　5、通过对流感病毒的长期监测,我们观察到近两年H5N1病毒的抗原性和基因型变迁过程,这表明:尽管流感病毒具有很大的变异性,难于控制和预测,长期监测对于探索流感病毒的进化规律、预测流行、研制疫苗等工作仍具重要指导作用。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

一 材料

1．实验仪器设备

2．实验试剂

3．其它材料

二、方法

1.病毒的分离

2.分子生物学

3. 基因分析

结果

一、 流行病学

二、抗原性分析

三、进化分析和基因型分析

四、分子特征

讨论

参考文献

致谢

§文献综述§

参考文献