Egr-1反义寡核苷酸对大鼠心肌细胞Egr-1蛋白表达及缺氧/复氧损伤的影响

摘要

心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤是目前心血管疾病治疗中亟待解决的问题之一。其损伤机制有多方面,其中炎症反应的发生是最重要的原因之一。近年来研究发现早期生长反应因子-1(Early growth response-1,Egr-1)与I/R中炎性损伤的发生具有密切关系。有文献报道Egr-1基因的诱导在I/R损伤中发挥关键性作用。本研究在细胞水平模拟心肌 I/R损伤,将人工设计合成的靶向 Egr-1-mRNA的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODN)转染入原代培养的乳鼠心肌细胞,观察其对心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)条件下Egr-1蛋白表达、细胞损伤及细胞炎症反应的影响,进而证实 Egr-1在心肌细胞 H/R损伤的形成与发展过程中占有重要地位,而 Egr-1 AS-ODN对心肌细胞的H/R损伤具有保护作用。
　　一、Egr-1 AS-ODN对大鼠心肌细胞Egr-1蛋白表达及炎症反应的影响
　　将心肌细胞原代培养于盖玻片上,转染异硫氰酸(FITC)标记的AS-ODN。PBS清洗细胞,丙酮固定,甘油封片。利用荧光显微镜在488nm的激发光源下观察荧光标记的寡核苷酸在心肌细胞的转染情况并照相。
　　实验用细胞随机分为六组:
　　1.正常对照组(N);
　　2.缺氧/复氧组(H/R);
　　3.脂质体组(LIP);
　　4.正义寡核苷酸转染组(S);
　　5.错配寡核苷酸转染组(Sc);
　　6.反义寡核苷酸转染组(AS)。
　　其中,2、3、4、5、6组分别做H/R模型。
　　收集心肌细胞,PBS清洗、离心、裂解,再次离心取上清。利用Western blot方法检测心肌细胞中Egr-1蛋白表达的变化。取细胞培养液用ELISA双抗体夹心法测定心肌细胞分泌的TNF-α水平。
　　结果:
　　1、荧光标记的AS-ODN在心肌细胞的转染效果: FITC标记的AS-ODN在488nm的激发光源下呈现绿色。荧光显微镜下绿色荧光的位置与同一视野下细胞所在位置相一致,说明AS-ODN成功转染进入心肌细胞。(图1-3)
　　2、Egr-1在各组中的蛋白表达分析:与H/R组比较,N组Egr-1蛋白表达明显较弱,差别有统计学意义(p<0.01),LIP组、S组、Sc组无明显差异(p>0.05),而AS组Egr-1蛋白表达明显减少,差别有统计学意义(p<0.01)。(图1-4)
　　3、各组心肌细胞分泌TNF-α水平比较:与N组相比,H/R组、LIP组、S组、Sc组心肌细胞分泌的TNF-α水平明显升高,差异有统计学意义(p<0.01);而H/R组与LIP组、S组和Sc组之间比较差异无统计学意义(p>0.05);AS组与H/R组相比,TNF-α分泌量下降,差异有统计学意义(p<0.01)。(表1-1)
　　结论:在心肌细胞 H/R条件下, Egr-1对于炎症发应的发生起到了一定的作用。应用AS-ODN能够抑制心肌细胞H/R过程中Egr-1的蛋白表达和细胞的炎症反应。
　　二、Egr-1 AS-ODN对H/R心肌细胞损伤的保护作用
　　各组心肌细胞做相应的处理后,利用倒置显微镜观察心肌细胞的生长状态和搏动频率。取细胞培养液,按照试剂盒说明测定乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性及肌钙蛋白(cTnI)含量。收集心肌细胞,超声粉碎,离心取上清,按照试剂盒说明,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。用酶消化制成细胞悬液,台盼蓝染色法检测心肌细胞存活率。
　　结果:
　　1、各组心肌细胞形态学观察:心肌细胞培养12-24h出现自发性搏动,72h后聚集成簇,呈现频率为80-100次/分的同步节律性搏动。细胞形态呈梭形或不规则三角形,伪足明显,可发生相互融合。H/R后心肌细胞皱缩变圆,伪足减少,缺氧3h细胞搏幅减弱、频率减慢甚至出现停搏。复氧1h后部分可恢复搏动,但出现节律失常现象。AS组细胞形态变化小于H/R组,搏动状态有所改善。但LIP组、S组及Sc组H/R后形态及搏动状态无明显改善。
　　2、各组心肌细胞培养液中LDH、CK活性和cTnI含量的比较:与N组相比,其余各组培养基中LDH、CK、cTnI的漏出量均增高,差异有统计学意义(p<0.01);而H/R组与LIP组、S组和Sc组之间比较差异则无统计学意义(p>0.05);AS组与H/R组、LIP组、S组、Sc组相比,LDH、CK、cTnI的漏出量明显降低,差异有统计学意义(p<0.01)。(表2-1)
　　3、各组心肌细胞SOD活性和MDA含量的比较:与N组相比,其余各组心肌细胞内MDA含量明显增高,SOD活力明显降低,差异有统计学意义(p<0.01);而H/R组与LIP组、S组和Sc组之间比较差异无统计学意义(p>0.05);AS组与H/R组、LIP组、S组、Sc组相比,MDA含量降低,SOD活力明显提高,差异有统计学意义(p<0.01)。(表2-2)
　　4、各组心肌细胞存活率比较:与N组相比,其余各组心肌细胞存活率均降低,差异有统计学意义(p<0.01);而H/R组与LIP组、S组和Sc组之间比较差异无统计学意义(p>0.05);AS组与H/R组、LIP组、S组、Sc组相比,心肌细胞存活率明显升高,差异有统计学意义(p<0.01)。(表2-3)
　　结论:Egr-1在心肌细胞 H/R损伤的发生与发展过程中发挥了重要作用,而应用 Egr-1 AS-ODN能够减弱心肌细胞的H/R损伤,提高心肌细胞的存活率,保护心肌细胞功能。

目录

目录

缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分Egr-1 AS-ODN对大鼠心肌细胞Egr-1蛋白表达及炎症反应的影响

材料和方法

1实验材料

2实验方法

3统计学处理

结果

1.AS-ODN在心肌细胞中的转染效果

2.AS-ODN对Egr-1蛋白水平的影响

3.各组心肌细胞TNF-α水平的比较

第二部分Egr-1 AS-ODN对心肌细胞H/R损伤相关指标的影响

材料和方法

1实验材料

2实验方法

3统计学处理

结果

1.AS-ODN对H/R心肌细胞形态的影响

2.AS-ODN对H/R心肌细胞损伤相关指标的影响

3.各组心肌细胞存活率的比较

讨论

一、选择幼龄大鼠心肌细胞制作H/R模型

二、H/R模型制作时间的选择

三、Egr-1 AS-ODN转染方法的选择

四、心肌细胞各损伤指标的选择与分析

五、Egr-1与心肌细胞H/R炎性损伤的关系

结论与展望

一、结论

二、展望

参考文献

论文综述

致谢