碘化N-正丁基氟哌啶醇对缺氧复氧大鼠心脏微血管内皮细胞Egr-1表达及细胞损伤的影响

摘要

早期生长反应基因-1(early growth response gene1, Egr-1)是即早基因家族的一员,能在众多刺激因素的作用下快速表达,介导细胞对外界环境改变的反应。缺氧或缺血可诱导Egr-1表达,进而引起其下游靶基因与凝血、炎症反应等相关因子的迅速表达,从而在心脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤中起到了中心性的作用。目前认为,炎性反应、凝血和血管高通透性是I/R所致心肌损伤的中心环节,在此过程中,内皮细胞功能紊乱是I/R损伤发生的始动环节。内皮细胞缺氧损伤后诱导Egr-1表达增高而促进炎症因子的释放,进而引起白细胞聚集粘附、血管收缩、血栓形成及内皮细胞肿胀造成无复流现象,加重I/R损伤。碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide, F2)是我课题组合成一个新化合物,在探讨其拮抗心肌I/R损伤新机制的过程中发现, F2可明显抑制I/R心肌组织或缺氧复氧( Hypoxia and Reoxygenation, H/R)心肌细胞中Egr-1基因及蛋白表达水平的升高,改善心肌功能,表明F2抗I/R损伤的作用与其对Egr-1基因和蛋白表达的抑制作用密切相关。本实验选取I/R损伤最先受累的内皮细胞作为研究对象,采用培养的心脏微血管内皮细胞H/R模型,观察F2对H/R所致内皮细胞损伤及Egr-1基因及蛋白表达以及炎症反应的影响,进一步探讨F2拮抗心肌I/R损伤的作用机制。
　　方法
　　1.进行大鼠心脏微血管内皮细胞(以下简称内皮细胞)原代培养及鉴定:倒置相差显微镜下观察培养内皮细胞形态结构,采用免疫细胞化学方法,对内皮细胞进行鉴定。
　　2.缺氧复氧模型的建立:培养的内皮细胞换用被高纯氮气饱和的缺氧液,置于密闭且充满氮气的缺氧箱中,37℃缺氧3 h,后又在正常培养条件下培养2 h,造成H/R损伤。
　　3.实验分组:取3-5代的内皮细胞随机分为五组:正常对照组(Control)、缺氧复氧组(H/R)、溶剂组(聚乙二醇400,PEG)、F2组和阳性对照药(维拉帕米,Verapamil, VER)组。F2组、VER组、PEG组于缺氧液及复氧液中分别给予F2(1×10-6 mol/L)、VER(1 mg/L)及等容积的PEG。Control组除外,其余各组均作H/R模型。
　　4. RT-PCR法检测培养内皮细胞中Egr-1 mRNA的表达水平。
　　5. Western-blot法及免疫细胞化学法检测培养内皮细胞中 Egr-1蛋白的表达水平及观察其亚细胞定位。
　　6. ELISA法测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β( interleukin-1 beta, IL-1β)、白细胞介素-6( interleukin-6, IL-6)、细胞间粘附分子-1( intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)的含量,以反映内皮细胞炎症程度。
　　7.用比色法测定髓过氧化酶(MPO)活性反映中性粒细胞粘附程度。
　　8.扫描电子显微镜(SEM)下观察内皮细胞同血小板的相互作用。
　　9.用比色法测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性,用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)的含量,黄嘌呤氧化酶法测定内皮细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,以反映内皮细胞损伤的程度。
　　结果
　　一、大鼠心脏微血管内皮细胞培养
　　经差速贴壁纯化后的细胞用免疫细胞化学鉴定,Ⅷ因子样物质阳性细胞达97％以上,在内皮细胞生长因子的培养基培养下生长较迅速,常规液氮冻存和复苏可维持良好的生长状况,表明分离培养后的细胞是内皮细胞。
　　二、F2对缺氧复氧心脏微血管内皮细胞Egr-1表达的影响
　　1.RT-PCR实验结果显示:与Control组相比,H/R组及PEG组内皮细胞中Egr-1 mRNA表达明显增高,但H/R组及PEG组之间的表达无明显差异。F2组和VER组Egr-1 mRNA的表达较I/R组明显下调。
　　2. Western-blot实验结果显示:与Control组相比,H/R组及PEG组内皮细胞中Egr-1蛋白表达明显增强,但H/R组及PEG组之间的表达无明显差异。F2组和VER组Egr-1蛋白的表达较H/R组明显下调。
　　3.免疫组织化学结果表明,Control组仅见个别内皮细胞胞核Egr-1蛋白弱阳性表达。H/R、PEG组内皮细胞Egr-1蛋白均有较强表达,且强阳性表达主要见于细胞胞核中;而F2组及VER组中Egr-1蛋白表达的程度均明显减弱。
　　三、F2对缺氧复氧心脏微血管内皮细胞炎症反应的影响
　　1. F2对培养内皮细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1分泌的影响: H/R组及PEG组培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1含量较Control组显著增高;而在缺氧液及复氧液中加入F2或VER则能明显抑制H/R所致内皮细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1的分泌。
　　2. F2对培养内皮细胞与中性粒细胞粘附的影响:MPO活性测定结果显示,与Control组相比,H/R组及PEG组内皮细胞MPO活性明显增高;F2组和VER组MPO活性较H/R组明显降低。
　　3. F2对培养内皮细胞同血小板相互作用的影响:SEM结果显示,与Control组相比,H/R组及PEG组内皮细胞表面聚集的血小板明显增多; F2组和VER组Egr-1血小板的聚集较H/R组明显减少。
　　四、F2对缺氧复氧心脏微血管内皮细胞损伤的影响
　　1. F2对培养内皮细胞上清液中LDH含量的影响:与Control组相比,H/R组及PEG组培养上清液中LDH含量显著增高(P<0.05)。F2组和VER组LDH含量明显降低(P<0.05)。
　　2. F2对培养内皮细胞SOD活力及MDA含量的影响:与Control组相比,H/R组及PEG组SOD活力显著降低,MDA含量显著增高,而在应用F2和VER以后,内皮细胞SOD活力明显升高(P<0.05),MDA含量明显降低(P<0.05)。
　　结论
　　1. H/R引起内皮细胞Egr-1 mRNA及蛋白的异常表达,进而引发细胞损伤、炎症反应。
　　2. F2可以抑制H/R所致内皮细胞Egr-1 mRNA及蛋白的异常表达,进而减轻内皮细胞H/R损伤、抑制炎症反应,保护内皮细胞,这可能是其抗心肌缺血再灌注损伤作用的机制之一。
　　3.内皮细胞是F2作用的主要靶细胞之一。

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缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

一、 材料和仪器

二、实验方法

结果

1. 原代培养内皮细胞形态观察及鉴定

2. 总RNA电泳图

3. F2对Egr-1 mRNA表达水平的影响

4. F2对Egr-1蛋白表达的影响

5．F2对培养内皮细胞上清液中TNF-α含量的影响

6．F2对培养内皮细胞上清液中IL-1β含量的影响

7．F2对培养内皮细胞上清液中IL-6含量的影响

8．F2对培养内皮细胞上清液中ICAM-1含量的影响

9．F2对培养内皮细胞上清液中LDH含量的影响

10．F2对培养内皮细胞中SOD含量的影响

11．F2对培养内皮细胞中MDA含量的影响

12．F2对培养内皮细胞与血小板相互作用的影响

13．F2对培养内皮细胞与中性粒细胞粘附MPO活性的影响

讨论

结论

参考文献

论文综述

致谢

附录

个人简历