中华眼镜蛇毒金属蛋白酶MT和烙铁头蛇毒TM-N49诱导人肥大细胞释放组胺的研究

摘要

背景与目的:
　　肥大细胞激活后脱颗粒释放类胰蛋白酶、类糜蛋白酶、肝素、组胺及其它化学介质成分,参与许多慢性炎症反应如应激诱发的肠道溃疡、类风湿关节炎、间质性膀胱炎、硬皮病及克隆氏病等,尤其是在变态反应性疾病中起着至关重要的作用。变态反应性炎症包括支气管哮喘、变应性鼻炎、变应性皮炎、食物及药物过敏等,发病率约占全球人口的30％-40%,并有逐年增长的趋势。由于变态反应性炎症对人类的危害极大,所以于2000年末被世界卫生组织定为三大非传染性疾病项目之一。近年,越来越多的证据证明肥大细胞激活后释放的主要介质可能是引起变态反应性炎症发病的关键机制。肥大细胞的这种脱颗粒反应,既是机体的一种防御反应,也是速发型变态反应和炎症等病理反应的基础,围绕稳定肥大细胞而产生的疗法将会成为今后一段时间内治疗变态反应性疾病的主流。探讨肥大细胞激活途径及其机制能给治疗变态反应性炎症及其它与肥大细胞相关的疾病的治疗提供新思路。
　　目前对于肥大细胞的IgE依赖性激活途径的研究已进行得很深入,其机制已开始明朗;但非IgE依赖性激活途径的确切作用机制还不甚明了。本研究所在“长江学者”何教授带领下经过多年努力,提出了肥大细胞自身放大机制的假说,并逐渐完善,这是对肥大细胞激活机制的新发现。
　　人被毒蛇咬伤后局部可见明显组织坏死和炎症,早期蛇毒与肥大细胞之间的作用在动物上研究过,发现眼镜蛇毒等能诱导大鼠横隔膜、腹膜和几尼猪肺部肥大细胞释放组胺,其激活肥大细胞的方式是非IgE依赖性的,但蛇毒对人肥大细胞的作用尚未见文献报道。我们用纯化的蛇毒MT、TM-N49与人肺、大肠及扁桃体组织肥大细胞共同孵育,观察其对人肥大细胞释放组胺的诱导作用,探讨人肥大细胞非 IgE依赖性激活的作用机制,给变态反应性炎症及其它相关疾病的治疗提供参考资料。
　　方法:
　　将粗中华眼镜蛇毒粉溶于缓冲液中,上肝素凝胶柱和Superdex75亲和力凝胶柱纯化MT;将粗烙铁头蛇毒粉溶于缓冲液中,上SP-Sephadex C-25柱,肝素凝胶柱, Superdex75分子筛及HPLC纯化TM-N49。将手术切除的人肺、大肠和扁桃体组织在无菌条件下细细剪碎,在37℃条件下用Ⅰ型胶原酶和Ⅰ型透明质酸酶消化,用100μm的滤网过滤,经悬浮后的细胞均匀地加入含MT、TM-N49、刺激剂或缓冲液的试管中,在37℃条件下进行激发实验,激发管在4℃离心机中2000 rpm离心10 min后,收集细胞激发上清,用荧光显色法测量上清液的组胺水平。
　　结果:
　　纯化后的MT在SDS-PAGE上呈1条带。MT能诱导人肺、大肠和扁桃体肥大细胞发生剂量依赖性组胺释放,其诱导方式为非 IgE依赖性。浓度低至0.03μg/ml时, MT就能诱导大肠肥大细胞显著性的组胺释放,但对于肺和扁桃体的肥大细胞, MT的最低有效浓度分别为0.3μg/ml和30μg/ml。 MT诱导大肠和肺肥大细胞组胺释放,12 min时达高峰,而扁桃体肥大细胞的组胺释放则在8 min时达高峰。人大肠、肺和扁桃体肥大细胞经代谢抑制剂和百日咳毒素预处理后,MT诱导其释放组胺的作用明显减弱。缺乏外源性钙、镁离子时,MT诱导肥大细胞释放组胺的能力也明显减弱。
　　纯化后的TM-N49在SDS-PAGE上呈一条带。TM-N49能诱导人肺、大肠和扁桃体肥大细胞发生剂量依赖性组胺释放。浓度为0.3μg/ml时, TM-N49就能诱导大肠肥大细胞显著性的组胺释放,但对于人肺肥大细胞来说,诱导它释放相同量组胺所需最低TM-N49浓度为3μg/ml,而对于扁桃体肥大细胞,TM-N49浓度为30μg/ml时才能诱导它显著性的组胺释。TM-N49诱导大肠和肺肥大细胞组胺的释放10 min和8 min时达高峰,而扁桃体肥大细胞的组胺释放则在16 min时达高峰。人大肠、肺和扁桃体肥大细胞经代谢抑制剂和百日咳毒素预先处理后,浓度低于30μg/ml的TM-N49诱导其释放组胺的作用明显减弱,但当其浓度达到30μg/ml时,上述处理对TM-N49诱导人肥大细胞释放组胺的作用无影响。缺乏外源性钙、镁离子时,TM-N49诱导肥大细胞释放组胺的能力也明显减弱。
　　结论:
　　蛇毒MT及TM-N49能通过非IgE依赖性途径激活肥大细胞使之脱颗粒释放相关介质,从而参与毒蛇咬伤人体后所发生的病理生理过程。蛇毒 MT及TM-N49非IgE依赖性途径激活肥大细胞具有组织特异性,其过程需要消耗细胞能量及要有外源性钙、镁离子存在,且与G蛋白偶联受体的活化密切相关。肝素能抑制蛇毒 MT及TM-N49通过非IgE依赖性途径激活肥大细胞。

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实验设备：

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第1章：中华眼镜蛇毒金属蛋白酶MT诱导人肥大细胞释放组胺的作用

1 前言

1.1蛇毒与肥大细胞作用的早期研究

1.2 肥大细胞的分布及其介质

1.3 肥大细胞在相关疾病中的重要作用

1.4 肥大细胞的激活机制

1.5 肥大细胞激活机制的研究新进展

2 实验材料：

3实验方法

3.1金属蛋白酶的分离纯化

3.2金属蛋白酶活性检测

3.3 金属蛋白酶的分子量测定

3.4 肥大细胞悬浮

3.5 肥大细胞激发

3.6组胺测定

3.7统计分析

4 实验结果

4.1 MT的分离纯化

4.2 MT诱导人肺、大肠和扁桃体肥大细胞释放组胺的作用

4.3钙、镁离子对MT诱导肺、大肠和扁桃体肥大细胞释放组胺的影响

4.4 MT诱导人肥大细胞释放组胺的时间关系

4.5 代谢抑制剂和百日咳毒素对肥大细胞组胺释放的影响

4.6肝素对MT诱导肥大细胞释放组胺的抑制作用

5 讨论

5.1研究肥大细胞激活途径的意义

5.2 蛇毒MT激活肥大细胞的途径

5.3 蛇毒MT非IgE依赖性激活肥大细胞的具体机制

5.4蛇毒MT非IgE依赖性激活肥大细胞的提示

6结论

参考文献

第二章：烙铁头蛇毒TM-N49诱导人肥大细胞释放组胺的作用

1前言

2实验材料

3实验方法

3.1TM-N49分离纯化

3.2TM-N49的分子量测定

3.3肥大细胞悬浮

3.4 肥大细胞激发

3.5组胺测定

3.6统计分析

4.实验结果

4.1 TM-N49的分离纯化及分子量

4.2TM-N49诱导人肺、大肠和扁桃体肥大细胞释放组胺的作用

4.3 钙、镁离子对TM-N49诱导肺、大肠和扁桃体肥大细胞释放组胺的影响

4.4 TM-N49诱导人肥大细胞释放组胺的时间关系

4.5代谢抑制剂和百日咳毒素对肥大细胞组胺释放的影响

4.6肝素对MT诱导肥大细胞释放组胺的抑制作用

5讨论

5.1研究肥大细胞激活途径的意义

5.2 蛇毒TM-N49激活肥大细胞的途径

5.3 蛇毒TM-N49非IgE依赖性激活肥大细胞的具体机制

5.4 蛇毒TM-N49非IgE依赖性激活肥大细胞的提示

6结论

参考文献

综述一：天然成分对肥大细胞的影响

综述二：肥大细胞激活途径研究进展

综述三：肥大细胞与疾病的关系

致谢

在学期间发表论文：