潮汕食管癌癌前病变浸润单个核细胞亚群与上皮增生以及表皮生长因子受体表达的初步研究

摘要

背景与目的:
　　在肿瘤的发生发展过程中,慢性炎症对上皮细胞的转化具有重要的促进作用。据估计,15％的癌症是由慢性炎症发展而成,但至今仍然不清楚这一演变过程。基底膜是细胞外基质的重要组成部分,对上皮细胞的增殖、分化、凋亡以及细胞极性具有重要的调控作用。基底膜作用的发挥依赖于其组成成分的稳定和空间结构的完整,其改变将引起上述调控作用的丧失从而可能引起细胞的生长分化障碍,导致肿瘤的发生。在引起基底膜改变的众多因素中,炎症反应是一重要因素。
　　本课题组前期实验发现,在正常粘膜上皮及固有层内少见炎症细胞,从单纯增生上皮开始,固有层内浸润炎症细胞逐渐增多,炎症反应由轻到重发展时,炎症细胞由在固有层内弥散分布到向上皮内浸润以及在固有层内聚集形成灶状细胞团,甚至形成淋巴滤泡,同时伴有食管基底膜不同程度的改变。基底膜的改变与炎症的程度有密切关联。
　　慢性炎症时局部浸润的炎症细胞可释放降解酶使基底膜成分降解,导致基底膜局部中断,炎症因子还可以激活细胞生长因子或者改变其传导途径促进细胞增生。生长因子(growth factor)是一类通过与特异、高亲和的细胞膜受体结合,调节细胞生长以及细胞其他功能的多肽类物质。各类生长因子都有其相应的受体,是普遍存在于细胞膜上的跨膜蛋白。表皮生长因子受体(EGFR)介导的信号传导通路的激活最终导致细胞进入一种持续的、不受控制的细胞分裂状态而形成肿瘤团块。临床研究已表明EGFR的高表达与肿瘤的发生密切相关,在许多恶性肿瘤细胞中已发现了EGFR的过度表达。
　　本试验通过观察食管慢性炎症时,浸润炎症细胞的数量与分布,应用不同的人白细胞分化抗原(CD3,CD8,CD20,CD68)对食管癌前上皮细胞增生过程中浸润的炎症细胞进行分类,分析炎症细胞在肿瘤发展过程中的作用以及和基底膜损伤的关系,同时观察上皮细胞增生过程中EGFR的总水平及其活性受体的表达变化,以及对上皮细胞增殖的影响,初步探讨浸润炎症细胞对基底膜的形态改变及对食管癌前病变上皮细胞增生的作用。
　　材料与方法:
　　标本来源:
　　新鲜标本44例:用于分析食管癌前上皮粘膜浸润炎症细胞的分型和检测PCNA的表达,其中15例标本(均为连续切片)检测了上皮细胞EGFR的表达。标本选自2004.10-2005.8期间汕头大学医学院病理教研室140余例食管手术切除标本。选取除肿瘤部位外在远隔部位及切缘合并有癌前病变(单纯增生、非典型增生、原位癌)的病理标本,所有标本肿瘤部位均有病理切片证实为鳞状细胞癌。对标本进行仔细观察与描述,详细记录组织肉眼特征,并对典型肿瘤病变部位以及远隔部位(粘膜有粗糙、糜烂或微小结节的异常区域)及上下切缘分别取样,另取15例非食管疾病尸体解剖病例正常食管粘膜作为对照组。合计食管正常上皮15例,单纯增生上皮39例,非典型增生21例,原位癌12例,浸润癌34例。
　　本教研室已制作组织芯片标本:用于食管粘膜上皮 EGFR表达的检测。共148例,来自2003.10-2005.5年间汕头大学医学院病理教研室食管手术切除标本,另取5例非食管疾病尸检病例正常食管粘膜和3例胚胎食管粘膜作为对照。采样点合计正常上皮19例、单纯增生上皮24例、非典型增生8例、原位癌20例、浸润癌119例。
　　研究方法:
　　对所有石蜡标本切片进行HE染色和PAS特殊染色,观察炎症细胞数量、分布和基底膜改变类型的关系,采用免疫组织化学EnVision二步法分别对CD3、CD8、CD20、CD68、EGFR、p-EGFR(Tyr845),p-EGFR(Tyr992), p-EGFR(Tyr1045), p-EGFR(Tyr1068)以及增殖相关抗原PCNA进行染色。
　　结果:
　　食管癌前病变浸润炎症细胞亚群观察
　　在单纯增生、非典型增生、原位癌等病变的上皮和固有层内以及浸润癌癌巢周围间质都呈现不同程度的炎症反应,各种炎症细胞在组织中分布极不均匀,并且炎症细胞数量在各病例之间的波动也较大。从单纯增生上皮开始,固有层内就有明显增多的炎症细胞浸润,以T细胞和巨噬细胞为主(两者合计占浸润细胞总数的57%)。全部病例组织中均可见T细胞和B细胞浸润。CD3+、CD8+T细胞表现为散在、弥漫、条带状分布,在粘膜下固有层距粘膜上皮较近处居多,可向上皮内浸润;CD20+B细胞散在分布者较少,常形成小灶状及淋巴滤泡样结构,分布于粘膜下固有层距粘膜上皮较远处,未见向上皮内浸润;77.3%(34/44例)食管标本可见CD68+巨噬细胞浸润,在食管组织中呈散在分布。
　　炎症细胞计数结果显示从单纯增生到非典型增生到浸润癌标本,细胞总数有增多的趋势,并且固有层淋巴滤泡数目增多。食管粘膜上皮内浸润炎症细胞包括T细胞(包括CD3和CD8阳性细胞)和巨噬细胞,以T细胞为主。从单纯增生到非典型增生、原位癌,CD3+、CD8+T细胞以及CD68+巨噬细胞的比例有减少的趋势,以CD8+T细胞的数量减少更为明显。浸润癌间质中的炎症细胞以CD3+的T细胞和CD68+巨噬细胞为主,其中巨噬细胞的比例较癌前组明显增加。
　　基底膜损伤区域中的浸润炎症细胞
　　PAS染色结果显示在食管单纯增生、非典型增生、原位癌等各种病变上皮组织中,食管基底膜均有不同程度的改变。慢性炎症时基底膜形态学改变可分为:点状缺失、灶状缺失以及增厚分支和变薄等病理学类型,在单纯增生组,基底膜改变以点状缺失和分支增厚为主,在非典型增生组多见灶状缺失,同时分支增厚更为多见并可见基底膜局部变薄,原位癌的基底膜则主要表现为分支增厚和局部变薄。
　　从正常食管粘膜上皮到浸润癌,PCNA的表达有增强的趋势,阳性细胞区域由上皮基底部逐渐至全层。在基底膜点状缺失区域,浸润的炎症细胞主要为T细胞(包括CD3+和CD8+)细胞,在灶状缺失区域,浸润的炎症细胞为T细胞和巨噬细胞,但以T细胞为主。灶状缺失固有层区域内浸润炎症细胞数量明显增多,其对应上皮PCNA的表达也增强。
　　EGFR在各组食管粘膜上皮的表达
　　EGFR阳性细胞的阳性颗粒均呈棕黄色,定位于胞浆和胞膜,以浸润癌表达最强,在癌组织内阳性细胞散在或巢状聚集分布。在149例石蜡食管浸润癌标本中,阳性表达率为49.6%(74/149)。正常食管粘膜上皮未见阳性表达,在表达阳性的食管浸润癌标本的对应单纯性增生上皮、非典型增生上皮中,可见EGFR阳性表达,单纯性增生、非典型增生与浸润癌EGFR阳性表达的灰度值有增强的趋势。
　　在EGFR阳性表达的浸润癌标本中,p-EGFR(Tyr845)和p-EGFR(Tyr992)可见阳性表达,均定位于胞浆,阳性细胞在瘤组织内散在分布,p-EGFR(Tyr1045)和p-EGFR(Tyr1068)未见阳性表达;在EGFR阴性表达的浸润癌样本中, p-EGFR(Tyr845),p-EGFR(Tyr992), p-EGFR(Tyr1045),p-EGFR(Tyr1068)均未见表达。
　　结论:
　　1.在食管癌癌前病变的上皮和固有层内均呈现不同程度的炎症反应,炎症细胞以T细胞、B细胞以及巨噬细胞为主,其中T细胞和巨噬细胞总数可占到全部浸润炎症细胞的57%。提示了T细胞和巨噬细胞在食管慢性炎症反应中发挥了重要的作用。从食管粘膜上皮单纯增生、非典型增生到原位癌,浸润炎症细胞总数有增多的趋势, CD3+及CD8+T细胞以及CD68+巨噬细胞的比例有减少的趋势,提示了食管癌癌前病变上皮增生过程中浸润炎症细胞构成的改变。
　　2.PAS染色结果显示在食管单纯增生、非典型增生、原位癌上皮组织中,基底膜均有不同程度的改变;从正常食管粘膜上皮到浸润癌,PCNA的表达有增强的趋势;基底膜灶状缺失浸润炎症细胞数量明显多于点状缺失,其对应上皮PCNA的表达也明显增强。基底膜损伤区域以及粘膜上皮内浸润的炎症细胞主要为T细胞和巨噬细胞,说明T细胞和巨噬细胞在慢性炎症时可能引起基底膜的改变,继而促进了上皮细胞的增生。
　　3.在49.6%的食管浸润癌中EGFR表达阳性;在正常食管粘膜上皮、单纯性增生、非典型增生、原位癌与浸润癌中,EGFR表达有增强的趋势。同时在EGFR阳性病例浸润癌中,p-EGFR(Tyr845)和p-EGFR(Tyr992)可见阳性表达,表明了在浸润癌中EGFR信号转导通路的激活。

目录

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封面

缩略语释义

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

一、材料

1标本来源：

2.实验分组

3.标本组成

4. 主要实验仪器

5. 主要试剂

二、方法

1. 组织的取材

2．HE染色

3. PAS特殊染色

4. 免疫组织化学染色

三、实验资料的统计分析

结果

结果一 浸润炎症细胞亚群分析

一、浸润炎症细胞的形态学特点

结果二、基底膜损伤区域中浸润的炎症细胞

1．基底膜形态学改变

2．正常组、单纯增生、非典型增生、原位癌、浸润癌组PCNA的表达

3．基底膜损伤区域的炎症细胞及其对应上皮PCNA的表达

结果三 EGFR的表达与食管粘膜上皮的增生

一、EGFR 表达在各组间的比较

二、EGFR活性受体的检测及与ERK/MAPK信号转导通路的联系

讨论

结论

参考文献

附图

附录

致谢

声明

食管慢性炎症与食管癌