聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白作为重组蛋白纯化系统亲和吸附标记的研究

摘要

Phasin是胞内聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHAs)颗粒表面的主要结合蛋白,为检测它在体外与疏水性颗粒的结合能力以及是否与PHA颗粒特异性结合,我们构建了颗粒结合蛋白Phasin、自裂解蛋白Intein和绿色荧光蛋白eGFP的融合表达质粒,并以表面为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的磁性纳米颗粒为吸附介质,在体外验证融合蛋白与颗粒的结合能力。实验结果表明,phasin可以在体外结合到PHA以外的疏水性颗粒表面,而且此结合是非特异性的。

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第1章 前 言

1.1 聚羟基脂肪酸酯（ PHA）概述

1.2 PHA颗粒表面结合蛋白

1.2.1 PHA合酶（ PhaC）

1.2.2 PHA降解酶（ PhaZ）

1.2.3 PHA颗粒结合蛋白（ PhaP, phasin）

1.2.4 调控蛋白（ PhaR）

1.3 蛋白纯化系统的研究现状

1.3.1 IMPACTTM-TWIN蛋白纯化系统简介

1.4 PHA颗粒结合蛋白的研究现状及应用

1.5 本论文的目的和意义

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种和质粒

2.1.2 分子生物学常用的工具酶

2.1.3 常用试剂盒

2.1.4 常用生化试剂

2.1.5 分子量标准物

2.1.6 聚合酶链式反应（PCR）用试剂

2.1.7 仪器和设备

2.2 实验方法

2.2.1 菌种保存方法

2.2.2 常用培养基的配制

2.2.3 分子生物学常用溶液及缓冲液的配制

2.2.4 分子生物学常规操作

2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2.2.6 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

2.2.7 细菌总蛋白裂解液的制备

2.2.8 蛋白质含量的测定

第3章 结果与讨论

3.1 质粒pPIIP的构建

3.1.1 PCR获得phaPAh

3.1.2 PCR克隆第一个CBD以外片断

3.1.3 PCR克隆第二个CBD以外的片断

3.1.4 酶切验证

3.2 Phasin-Intein-EGFP融合质粒的构建

3.2.1 eGFP的PCR克隆

3.2.2 XhoI/BamHI双酶切质粒pPIIP

3.2.3 pPIEGFP酶切验证

3.3 Phasin-Intein-EGFP融合蛋白表达

3.3.1 pPIEGFP质粒转染E. coli BL21（DE3）

3.3.2 E. coli BL21(DE3) (pPIEGFP)重组菌诱导表达

3.4 融合蛋白与PMMA颗粒的体外结合实验

3.5 讨论与小结

结论

参考文献

个人简历及发表论文

致谢