维甲酸(RA)诱导F9干细胞分化过程中甲胎蛋白基因表达及其甲基化

摘要

[背景和目的]
　　甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是胚胎期主要的血清蛋白,产生于胎肝和卵黄囊。它在胚胎中的浓度很高,出生后迅速降低,到成人期几乎检测不到。由于AFP基因组织和发育的特异性表达,可作为研究真核基因调控的典型模型。甲胎蛋白基因的调控主要是转录水平的,而DNA甲基化是基因表达调控中一种常见而又重要的机制,弄清甲基化对甲胎蛋白基因表达的调控有着重要意义。在AFP基因及其调节区的甲基化与AFP基因表达的相关性显示出相反的结果。在胚胎和成人肝细胞中,AFP的表达水平和该结构基因的去甲基化水平没有显示出明显的相关性。只有存在于AFP基因5’端和第1个外显子的少数几个关键位点的甲基化水平与AFP基因活性表现出相关性。F9干细胞是来源于小鼠畸胎瘤的胚胎干细胞。当悬浮培养F9细胞并用RA处理时,F9细胞聚集成细胞团,并且在细胞团外围的大多数细胞会分化成内脏内胚层细胞,同时产生AFP作为一个分化分子标记。本实验以RA诱导F9干细胞分化产生AFP,用RT-PCR检测AFP表达水平的变化,同时检测AFP基因及上游调控区的甲基化水平,以寻找两者的相关性,确定与AFP表达存在相关性的关键性甲基化位点。
　　[材料和方法]
　　1.诱导F9细胞分化,建立F9细胞分化模型,倒置相差显微镜下观察细胞分化形态学变化。
　　2.半定量RT-PCR检测AFP mRNA的表达变化,电泳后进行灰度值分析,得出F9细胞分化过程中的相对表达量。
　　3.MSP检测不同位点在不同分化阶段的甲基化状况,甲基化位点处于基因的不同位置,包括基因上游启动子区、非启动子区以及基因内含子中。
　　[结果]
　　1. F9细胞经过RA处理后,细胞最终形成简单拟胚体:细胞团出现分层,外层为大的细胞界限清楚的内胚层样细胞,中间为一层基底膜,基底膜里包裹的是细胞界限不清楚的未分化的紧密细胞。这些是F9分化的形态学表现。
　　2.AFP在F9细胞分化过程中表达出现变化,第0天到3天AFP不表达,第4天到10天开始表达并成增加趋势,在第10天表达量最高,到第11天表达量大大减少,第12天几乎不表达AFP。
　　3.不同位点在不同时间的甲基化状态不一:甲基化位点1和甲基化位点5在不同时间的甲基化状态不变,甲基化位点1均为非甲基化,甲基化位点5均为甲基化;而甲基化位点2、甲基化位点3和甲基化位点4在不同时间的甲基化状态出现不同程度的改变,其中以甲基化位点2和甲基化位点3变化最明显,与AFP的表达变化呈现一定的关系,在AFP表达开始出现的第3、4两天,甲基化程度有所下降。
　　[结论]
　　1.成功建立RA诱导F9干细胞分化模型。从形态上观察,F9细胞形成简单拟胚体。而AFP的诱导表达更加证实了F9细胞分化模型的成功建立。
　　2.位于AFP基因上游CpG岛的甲基化位点1以及位于AFP基因上游非启动子区的甲基化位点5在 AFP诱导表达的过程中甲基化状态保持不变,甲基化位点1均为非甲基化,甲基化位点5均为甲基化,提示甲基化位点1和甲基化位点5的甲基化状态与AFP的表达不相关。
　　3.位于AFP基因上游CpG岛的甲基化位点2的甲基化状态在AFP诱导表达的过程中变化明显:在AFP mRNA未检测出的第0天到第3天甲基化程度较高,在随后的诱导过程中,AFP mRNA明显上调,甲基化程度与之前相比明显下降。该位点的甲基化状态与AFP的表达存在明显的相关性。
　　4.位于AFP基因第一个内含子的甲基化位点3的甲基化状态与AFP基因的表达存在一定的联系。此位点由甲基化到非甲基化的转变能促进本来沉默的AFP基因的表达,但是一旦AFP基因表达开始,该位点的甲基化并不能沉默AFP基因。
　　5.位于AFP基因上游CpG岛的甲基化位点4的甲基化状态与AFP基因表达的关系不明确,有待进一步由其他方法进行探讨和证实。

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中文摘要

英文摘要

英文缩略词

前言

材料和方法

一、 材料

1. 细胞株

2.主要试剂

3.主要仪器与设备

二、 实验方法

1.RA 诱导F9细胞分化模型的建立

2.细胞形态观察

3．半定量RT-PCR

4. 甲基化特异性PCR（Methylation Specific PCR，MSP）

实验结果

1. RA诱导F9细胞分化模型的建立

2．AFP的表达变化

3.甲基化状态

讨论

结论

参考文献

附录1:试剂配制

附录2：MSP简介

DNA甲基化对甲胎蛋白基因表达的调节（综述）

致谢