苦参碱对人白血病K562细胞表观遗传因素影响的机制研究

摘要

苦参碱是中药苦参的主要成分之一,我们前期研究发现苦参碱诱导了人白血病K562细胞分化和凋亡,但是分子机制尚不清楚。DNA甲基化是表观遗传学的重要机制之一,在肿瘤的基因异常表达起着重要作用。文献报道RIZ1基因是一种抑癌基因,在K562细胞中由于RIZ1基因启动子高甲基化导致其表达低下。在本论文中我们分别采用RT-PCR和甲基化特异性PCR(MSP)技术研究了苦参碱作用K562细胞后,其RIZ1基因mRNA表达水平和RIZ1基因启动子甲基化情况。同时我们还运用毛细管电泳(HPCE)、高效液相(HPLC)和甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)技术检测了苦参碱对K562细胞基因组整体甲基化的影响。此外,利用RT-PCR技术还测定了RIZ1下游基因IGF-1 mRNA水平的表达情况。
　　结果:
　　1.通过实验发现RIZ1基因的mRNA在对照组K562细胞低表达,经苦参碱和苦参提取液作用K562细胞后,RIZ1mRNA水平表达明显升高,并呈时间依赖性;同样,5-Aza CdR作用K562细胞后,RIZ1mRNA水平表达也明显增高。
　　2.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞后,RIZ1基因启动子发生去甲基化。
　　3.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后DNMT1 mRNA、DNMT3B mRNA表达无明显变化。
　　4. HPCE、HPLC法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞后基因组整体甲基化水平较处理前稍降低。
　　5.用酶切法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后对基因组整体甲基化水平无明显影响。
　　6.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后IGF-1 mRNA表达无明显变化。
　　结论:
　　1. K562细胞抑癌基因RIZ1启动子是处于高甲基化状态,导致该基因低表达。苦参碱和苦参提取液作用K562细胞后,RIZ1mRNA水平表达明显升高,说明苦参碱抗白血病作用与诱导抑癌基因 RIZ1表达有关。苦参碱诱导 K562细胞抑癌基因 RIZ1上调与中药苦参提取液作用一致,提示苦参碱是苦参抗肿瘤作用的主要活性成分。
　　2.实验结果显示苦参碱、苦参提取液和5-Aza CdR处理K562细胞后RIZ1启动子发生去甲基化,提示RIZ1基因被诱导表达上调是RIZ1基因启动子去甲基化作用所致。
　　3.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞前后DNMT1 mRNA、DNMT3B mRNA表达无明显变化,说明苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR未通过调控DNMTsmRNA转录水平而诱导DNA去甲基化。
　　4. HPCE、HPLC法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理后基因组整体甲基化水平较处理前稍降低,而用甲基化敏感性限制性内切酶法检测K562细胞在苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理前后对基因组整体甲基化水平无明显影响,综合说明苦参碱、苦参提取液对K562细胞基因组DNA整体甲基化水平无明显作用。
　　5.苦参碱、苦参提取液、5-Aza CdR处理K562细胞后,RIZ1基因下游的IGF-1基因 mRNA并没有随RIZ1表达上调而发生明显变化,其原因在本研究中尚不清楚。

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英文缩写词表

中文摘要

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技术路线

前言

参考文献

第一部分 苦参碱诱导白血病K562细胞抑癌基因RIZ1的表达

实验材料

实验方法

结果讨论

参考文献

第二部分 苦参碱诱导K562细胞抑癌基因RIZ1表达机制的实验研究

第一节 苦参碱诱导K562细胞RIZ1启动子DNA去甲基化的实验研究

实验材料

实验方法

实验结果

结果讨论

参考文献

第二节 苦参碱诱导K562细胞RIZ1基因启动子DNA去甲基化与DNMTs的相关性

实验材料

实验方法

实验结果

结果讨论

参考文献

第三节 苦参碱诱导K562细胞基因组DNA整体甲基化的实验研究

实验材料

实验方法

实验结果

结果讨论

参考文献

第三部分 苦参碱对K562细胞RIZ1的下游基因IGF-1的影响的研究

实验材料

实验方法

结果与讨论

参考文献

全文结论

文献综述

致谢

附录