食管癌细胞中NGAL基因新型TPA反应元件结合蛋白的克隆与鉴定

摘要

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白编码基因NGAL(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)是人类的一个重要的肿瘤相关基因,在结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌和食管癌等肿瘤中显著异常过表达。我们以往曾研究发现,食管癌细胞NGAL基因的过表达具有明显的TPA诱导性,在启动子-152~-60区段存在着一种新型的TPA反应元件(TPA Response Element,TRE),但是元件的结合蛋白尚未被鉴定出来。本课题组综合运用寡核苷酸DNA亲和层析和MALDI-TOF-MS等实验方法,对上述NGAL基因的TRE结合蛋白进行了分离纯化。为了进一步鉴定该TRE结合蛋白,本文进一步应用分子克隆、RT-PCR、双荧光素酶报告基因活性检测以及蛋白印迹等技术手段,结合生物信息学分析,研究确定了NGAL基因的新型TRE结合蛋白以及介导NGAL基因表达调控的细胞信号转导通路。
　　首先,我们利用生物信息学软件对 MALDI-TOF-MS质谱结果给予进一步分析,根据蛋白质的结构功能,细胞定位和分子量等指标确定了8个候选核蛋白因子:C19、KIAA1949、TDRD1、RXRβ、FAM54A、KLF15、KLF10和YY1。然后利用RT-PCR验证了这些核蛋白因子编码基因转录的TPA反应性。结果表明,C19、KIAA1949、TDRD1、RXRβ和KLF15等5个基因转录的TPA反应性明显,提示可能是食管癌细胞中应答TPA刺激,参与NGAL基因过表达的转录激活因子。
　　为了进一步研究确定上述候选核蛋白因子与NGAL基因TPA反应元件的相互作用关系,首先采用RT-PCR技术从EC109细胞中克隆获得C19、KLF10、KLF15、KIAA1949和RXRβ等基因的cDNA全长,分别插入质粒pcDNA3,成功构建了C19、KLF10、KLF15、KIAA1949和RXRβ的pcDNA3系列表达载体,并进一步获得分别稳定表达C19、KLF10、KLF15、KIAA1949和RXRβ的EC109食管癌细胞系。接下来,利用双荧光素酶报告基因检测系统研究确定,上述候选核蛋白因子C19、KLF10、KLF15、KIAA1949和RXRβ等可明显提高NGAL基因启动子的活性。
　　为了研究确定TPA信号是如何由细胞外传至细胞内调控NGAL基因表达的,本文首先利用蛋白印迹技术,检测了TPA处理不同时间EC109细胞中,NGAL蛋白的表达情况,结果发现NGAL蛋白随TPA处理时间的不同而呈现先增强后减弱这一变化规律,TPA处理12h时,NGAL蛋白表达最强。这个结果进一步说明,NGAL基因的表达的确具有TPA反应性。接下来,我们又选用PKC和MAPK细胞信号转导通路特异性抑制剂,联合运用双荧光素酶报告基因检测技术和蛋白印迹技术,研究确定了TPA诱导NGAL基因表达的细胞信号转导通路。报告基因检测结果表明,1)NGAL基因启动子的TPA反应性主要由MAPK细胞信号转导通路介导,但相比之下,其中的MEK(ERK)的效果比p38和JNK的更明显,发挥主要作用;2)经典的PKC细胞信号转导通路对NGAL基因启动子的TPA反应性未见明显影响。另外,蛋白印迹结果表明,在 EC109细胞中,1)ERK1/2表达不受 TPA诱导影响,而磷酸化修饰形式p-ERK1/2随着TPA(5ng/ml)刺激3h、6h、12h和24h等不同时间的变化,呈现先增强后减弱变化规律,TPA刺激12h达到最强,与 TPA处理的EC109细胞NGAL蛋白表达变化情况一致,然而,p-JNK未出现相应变化;2)用不同浓度的MEK抑制剂U0126预处理EC109细胞1h,再加入TPA作用3h、6h、12h和24h等不同时间发现,下游激酶ERK1/2蛋白总量未变,而p-ERK1/2蛋白发生了不同程度的降低,并且具有时间依赖性;3)不同浓度的JNK抑制剂处理EC109细胞1h,再加入TPA作用24h,与对照组比较,p-JNK未发生明显变化。综合以上所述可见,MEK特异性抑制剂能够有效阻断TPA引发的食管癌细胞EC109的细胞信号转导,降低NGAL基因的表达。
　　另外,为了确定TRE结合蛋白是否是MEK→ERK细胞信号转导通路的直接激活对象,与NGAL基因过表达相关,本文通过RT-PCR发现,EC109细胞,MEK特异性抑制剂处理后,C19、RXRβ、KLF10、KLF15和KIAA1949等基因mRNA的表达未受明显影响。这提示,上述基因本身的表达可能与其它细胞信号转导通路相关。
　　生物信息学分析发现,C19、RXRβ、KLF10、KLF15和KIAA1949等核蛋白均含有较多的潜在的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点,可能是接受由MEK→ERK通路由外向内传递活性信号的承接点,激活NGAL基因过表达。
　　综上所述可见,C19、KLF10、KLF15、KIAA1949和RXRβ等可能是应答 NGAL基因新型TPA反应性的核蛋白因子,而且可能主要是通过MEK→ERK细胞信号转导通路介导核蛋白磷酸化修饰活化,进一步激活 NGAL基因过表达。这些结果的阐明,将为进一步确定NGAL是应答TPA等促癌物刺激的一个新靶基因,理顺TPA信号在细胞外刺激与靶基因NGAL在细胞内应答这一新的细胞信号转导途径,深入到分子水平探明食管上皮细胞癌变中NGAL基因过表达原因提供依据。

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第一章 绪论

1.1 背景

1.2 本项研究课题的基金来源及相关课题情况

1.3 本项研究课题的研究意义

1.4 研究目标与研究内容

第二章 NGAL基因新型TPA反应元件结合蛋白的筛选、克隆与鉴定

2.1 引言

2.2 研究方案和技术路线

2.3 材料和方法

2.4 结 果

2.5 讨论

2.6 本章小结

第三章 介导NGAL基因表达调控的信号通路研究

3.1 引言

3.2 研究方案及技术路线

3.3 材料和方法

3.4 结果

3.5 讨论

3.6 本章小结

结论

参考文献

致谢

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