白藜芦醇对氧化应激诱导的心肌细胞凋亡及SIRTs表达的影响

摘要

目的：①研究白藜芦醇对氧化应激诱导的心肌细胞凋亡的保护作用；②探讨白藜芦醇对SIRTs (SIRT1-7)的表达影响。
　　 方法：大鼠心肌细胞株H9c2培养48h后随机分为3组，①正常对照组：不行任何处理；②氧化应激组：弃去旧培养液，加入不含血清的DMEM，培养30 min 后再加入终浓度为50μmol/L H2O2；③20 μmol/L 白藜芦醇(resveratrol, Res)干预组：在加入H2O2 前30 min 加入20 μmol/L Res 预处理。以上各实验组细胞在37℃条件下继续培养6 h 后终止。试验各组细胞检测指标均相同。噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活力；末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP 切口末端标记(TUNEL)技术和流式细胞仪(FCM) PI 染色法分析细胞凋亡；RT-PCR 法检测SIRT1-7 mRNA表达水平的变化；Western blot法检测SIRT1-7 及Caspase-3 蛋白表达的变化。
　　 结果：⑴为分析不同浓度Res对H9c2细胞活力的影响，分别用0、10、20、50、100μM Res处理24 h进行MTT检测。结果表明：10μM和20μM处理组光密度值(OD值)均高于对照组，20μM Res组作用最显著(P<0.05)，50μM组开始下降，低于对照组(P>0.05)，100μM组降至最低(P<0.05)。⑵H9c2细胞分别用10, 50和100 μM H2O2 处理6 h后，用MTT法检测细胞活力。结果表明：各处理组的光密度值均低于正常对照组，与正常对照组比较，50μM组(P<0.05)，而100μM组(P<0.01)；在加入H2O2前，用20 μM Res预处理30 min发现心肌细胞活力明显升高，以50 μM组最显著(P<0.05)。⑶TUNEL法检测细胞凋亡率在正常对照组细胞为1.56％，氧化应激6 h后细胞的凋亡率(16.98％)明显增加(P<0.05)，Res干预组(8.65％)较氧化应激组明显降低(P<0.05)。FCM法分析Sub-G1百分率结果和TUNEL法结果一致。正常对照组的细胞未见亚二倍体凋亡峰(Sub-G1＝1.04％)；50 μM H2O2处理6h后，在G0/G1期峰前出现亚二倍体凋亡峰(Sub-G1＝8.56％)；而20μM Res预处理后亚二倍体凋亡峰减小(Sub-G1＝1.98％)。但是，在Res预处理前加用sirtuin抑制剂尼克酰胺(nicotinamide, Nam)阻断SIRTs的表达后，Res的抗凋亡作用被逆转。与Res干预组比较，Nam干预组细胞凋亡率(18.23％)及Sub-G1百分率(9.01％)明显升高(P<0.05)。⑷H9c2细胞用50 μM H2O2 处理6 h 后，SIRT1,3,4,7 mRNA的表达与正常对照组比较明显降低(P<0.05)；而20 μM Res预处理后，SIRT1,3,4,7 mRNA的表达与氧化应激组比较明显增加(P<0.05)。SIRT2, 5, 6 mRNA的表达在三组中没有差异。⑸SIRT1-7 蛋白表达水平的变化与SIRT 1-7 mRNA表达水平的变化一致。H9c2细胞用50μM H2O2 处理6h后，内源性SIRT1,3,4,7的表达与正常对照组比较明显降低(P<0.05)；而20 μM Res预处理后，SIRT1,3,4,7的表达与氧化应激组比较明显增加(P<0.05)。SIRT2, 5, 6的表达在三组中没有差异。⑹Caspase-3在正常对照组表达最低，H2O2处理后它的表达明显增加(P<0.05)，而Res干预组较氧化应激组明显降低(P<0.05)。
　　 结论：①Res能抑制氧化应激诱导的心肌细胞凋亡；②Res在氧化应激情况下能够同时激活SIRT1,3,4,7，而对SIRT2,5,6的表达没有影响；③推测Res的保护作用可能与SIRT1,3,4,7的抗应激作用相关。