人前脑啡肽基因修饰的人骨髓间充质干细胞系的构建及其生物学特性的实验研究

摘要

背景和目的:
　　 慢性疼痛的治疗是目前人类尚未解决的难题之一，严重地影响了人类的生活质量，由于目前临床使用的镇痛药物存在的缺陷，疗效不能令人满意。生物镇痛由于其模拟人体生理分泌的独有的特点，具有明显的优势，是未来疼痛治疗的新方向，而转基因细胞移植镇痛（Transplantation of transgeneic cells for analgesia）则是其中的最具有的发展潜力的方向。
　　 骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）来源丰富，组织相容性好，免疫原性低，具有多向分化潜能，是较为理想的移植细胞。内源性阿片肽脑啡肽，广泛分布于外周和中枢神经系统(Central nervous system, CNS)，是一种重要的镇痛介质。本研究拟利用RT-PCR 法构建人前脑啡肽基因（proenkephalin, PENK）的逆转录病毒表达载体，建立能表达前脑啡肽基因及分泌脑啡肽蛋白的人骨髓间充质干细胞系并对其进行生物学特性的鉴定，为疼痛的基因治疗的实验研究奠定基础。
　　 材料和方法:
　　 1 携带人前脑啡肽基因的逆转录病毒载体的构建从人肾上腺嗜铬细胞瘤组织中提取总RNA，RT-PCR 法扩增出前脑啡肽基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Sal I酶切PCR 产物，定向克隆入pBABE puro载体，重组质粒pBABE-PENK经酶切及测序鉴定。
　　 2 人前脑啡肽基因修饰的人骨髓间充质干细胞系的建立及其生物学特性研究采用直接贴壁法从人骨髓标本中分离hMSCs。采用脂质体介导将重组质粒pBABE-PENK 转染包装病毒细胞株PHOENIX-293T 细胞，收集病毒上清，将其感染人骨髓间充质干细胞，经过嘌呤霉素筛选得稳定表达PENK的骨髓间充质干细胞细胞系。选用连续传代培养人前脑啡肽基因修饰的人骨髓间充质干细胞系的和未转化的人骨髓间充质干细胞，观察传代、冻存和复苏对细胞形态及生长的影响；比较两种细胞的生长特性和绘制生长曲线；流式细胞仪检测转染两组细胞的表面标志CD44，CD29，CD34，CD45的表达。将转染前后细胞分别行成脂诱导及成骨诱导，诱导后脂肪细胞油红染色，成骨细胞茜素红染色观察。分别用RT-PCR方法检测PENK基因的表达、免疫荧光法及酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法测定亮氨酸脑啡肽(Leu-enkephalin,LEK）的表达。
　　 3 统计分析：
　　 实验结果以均数±标准差（SD X ± )或均数±标准误（X S X ± )表示。定量资料经正态和方差齐性检验后，组间均数的比较采用单因素方差分析及双因素析因分析，组间两两比较采用LSD方法分析，以p<0.05 作为差异有显著意义的检验标准。采用SPSS17.0 统计软件包处理。
　　 结果:
　　 1 重组质粒pBABE-PENK经EcoR I、Sal I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人PENK基因完整编码区。
　　 2 转染后细胞系可在体外连续传代至20代以上；传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无影响（P=0.386）。与第4代hMSCs相比，转染后细胞的生长情况没有明显差异（P=0.873）。
　　 流式细胞仪检测转染前后细胞表明标志没有明显差异：CD29（P=0.136）、CD44（P=0.352）
　　 表达均（+），而CD34（P=0.466）、CD45（P=0.474）表达均（-）；转染前后细胞均可在体外培养条件上诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞，与第4代hMSCs 相比，转染后细胞成脂分化能力没有明显差异（P=0.944）。RT-PCR 及免疫荧光法证实hMSC-PENK中PENK基因表达水平升高且细胞内LEK含量升高， ELISA法检测到细胞培养液上清中LEK表达量增高（P<0.001）。
　　 结论:
　　 1 成功构建了含人前脑啡肽原基因的逆转录病毒载体。
　　 2 成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的人骨髓间充质干细胞系，可在体外能长期培养并维持分裂增殖能力，保留了原始人骨髓间充质干细胞特征性的分化表型及多向分化能力，该细胞系可在体外稳定表达和分泌脑啡肽，可将其作为转基因细胞移植镇痛的种子细胞做更进一步的研究。

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文摘

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论文说明:英文缩略词

声明

背景与目的

第1 章人前脑啡肽基因逆转录病毒载体的构建

第2章人前脑啡肽基因修饰的人骨髓间充质干细胞系的建立及其生物学特性研究

参考文献

综述 转基因细胞移植与生物镇痛的研究进展

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