一种具有稳定表达能力的新型质粒的构建

摘要

经过初期的波动,基因治疗目前已渐趋成熟阶段。有效的基因治疗依赖于外源基因在受体中高效、稳定的表达,而这在很大程度上取决基因治疗所采用的载体系统。慢病毒载体由于其广谱性、低免疫刺激性和稳定表达性,已成为最为理想的基因转移工具。然而,慢病毒载体的一些缺陷严重妨碍其在疾病治疗方面的运用,如慢病毒载体的制备过程复杂,费时费力滴度低,并仍然存在生物安全性问题。本课题的主要工作是改造慢病毒载体,即利用慢病毒的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)和整合酶,构建一种新型具有稳定表达能力的质粒。该质粒携带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein gene,EGFP)报告基因,因而在荧光显微镜下可直接观察稳定表达外源基因的细胞。转染Ad293细胞14天后,有些细胞持续表达EGFP,认为该细胞是发生了整合。本研究还利用Southern Blotting和反向PCR,探索质粒的整合及整合位点趋向性。实验结果表明,该质粒有稳定表达外源基因的能力,然而,其整合性尚未得到进一步验证。因此,本研究构建的质粒既有慢病毒载体所具有的稳定表达功能,又克服了慢病毒载体的危险性,以及制备过程中的复杂性,有望在基因治疗中发挥重要作用。

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第一章 引 言

1.1 基因治疗

1.2 基因治疗的发展

1.3 基因治疗载体

1.6 整合原理

第二章 实验材料与方法

2.1 试剂与耗材

2.2 主要仪器设备

2.3 实验方法

第三章 结果与分析

3.1 慢病毒整合酶的克隆、表达与检测

3.2 构建报告质粒pCMV-EGFP-SV40-DsRed

3.3 构建质粒pCMV-EGFP/?U3LTR2-SV40-DsRed

3.4 构建单质粒pCMV-EGFP/?U3LTR2-CMV-IN整合系统

3.5 单质粒系统整合能力的检测

3.6 双质粒系统整合能力的检测

3.8 反向PCR验证整合

第四部分 讨论与展望

4.1 与其他转座子系统的比较

4.2 整合效率检测

4.3 转座子结构对整合效率的影响

4.4 转座子和转座酶比例影响转座

4.5 辅助蛋白因子影响转座

4.6 二价阳离子与转座效率

4.7 Southern Blot 验证整合

4.8 反向PCR研究整合位点

4.9 下一步工作计划

4.10 意义与展望

参考文献

附录一 试剂配制

附录二 相关载体

附录三 Markers

致谢

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