流感病毒感染神经胶质细胞条件上清的免疫生物学效应

摘要

1.背景和目的：
　　流感急性脑病（influenza acute encephalopathy，IAE）是流感病毒感染的重要并发症之一，患者在病毒感染后在呼吸道症状出现1-2天内发生严重的神经症状，表现为快速发展的认知障碍、精神状态改变、意识消退、昏迷等，严重时引起神经后遗症或死亡。目前， IAE的发病机制依然不明。在流感急性脑病病人的脑脊液(CSF)和血浆中，发现TNF-α、IL-1等促炎症细胞因子的浓度升高。认为流感急性脑病可能是因机体在感染流感病毒后释放促炎症因子，进而诱导了细胞因子级联反应，造成中枢神经系统(CNS)发生以促炎症因子和趋化因子过度释放为特征的细胞因子风暴（cytokinne storm），引发神经及免疫系统功能紊乱和CNS的免疫病理损伤[1-3]。
　　我们前期研究发现流感病毒可以感染星形胶质细胞和小胶质细胞，并造成大量促炎细胞因子和趋化因子释放。而由流感病毒感染胶质细胞所释放的大量细胞因子对正常胶质细胞生物学功能有何影响尚未见报道。因此，本研究利用人流感病毒H1N1和H3N2感染小鼠星形胶质细胞获得条件上清，利用条件上清刺激正常星形胶质细胞和小胶质细胞，检测相关促炎细胞因子和趋化因子的转录水平变化，及TNF-α,IL-6,IL-1β的蛋白表达水平变化，为研究IAE所伴随的细胞因子级联放大及细胞因子风暴提供依据。
　　2.方法：
　　2.1 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)和A/Shantou/602/2006(H3N2)流感病毒株在MDCK细胞系中的增殖、保存及病毒滴度的测定。
　　2.2原代BALB/C小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的培养，利用间接免疫荧光法鉴定细胞纯度。
　　2.3不同亚型流感病毒株(H1N1,H3N2)感染星型胶质细胞(MOI=2)，感染6h、24h后，收获细胞上清液。
　　2.4利用超滤分子截留技术(截留分子量为300kD)，对细胞上清液进行超滤，获得条件上清液。
　　2.5流感病毒血凝实验检测处理后的条件上清液中流感病毒颗粒。
　　2.6 CCK8法检测条件上清液对原代BALB/C小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞，细胞活性的影响。
　　2.7条件上清液分别刺激原代BALB/C小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞，24h后提取RNA，并反转录成cDNA。RealTime PCR法检测促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，趋化因子IP-10、MCP-1、MIP-1转录水平的变化。
　　2.8条件上清刺激原代BALB/C小鼠星形胶质细胞，ELISA法检测不同时间点细胞上清液中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白含量，Western Blotting法检测GFAP蛋白的表达情况。
　　2.9条件上清液刺激原代BALB/C小鼠小胶质细胞，Trans well法检测小胶质细胞迁移情况。
　　3.结果：
　　3.1通过间接免疫荧光鉴定，成功完成对原代BALB/C小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞培养，细胞纯度达95％以上。
　　3.2利用空斑法检测，H1N1和H3N2流感病毒滴度为1×107PFU/ml。
　　3.3通过血凝实验检测，条件上清液中无法检测到流感病毒颗粒。
　　3.4 RealTime PCR结果表明，条件上清液分别刺激原代BALB/C小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞24h后,皆可诱导正常胶质细胞的促炎症因子和趋化因子的转录水平发生不同程度的上调。
　　3.5 CCK-8检测结果表明，条件上清液分别刺激原代BALB/C小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞24h后，与对照组比较，刺激组细胞活性被抑制。
　　3.6 Western Blotting法检测结果表明，条件上清液刺激原代BALB/C小鼠星形胶质细胞后， GFAP蛋白表达水平发生上调。
　　3.7 ELISA法检测结果表明，条件上清液刺激原代BALB/C小鼠星形胶质细胞后，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6在不同时间点的蛋白表达水平发生不同程度改变,总体呈下降趋势。
　　3.8 Trans well法检测结果表明，条件上清刺激原代BALB/C小鼠小胶质细胞24h后，小胶质细胞迁移率未发生上调。
　　4.结论：
　　4.1流感病毒感染星形胶质细胞条件上清液分别刺激原代BALB/C小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞后,皆可诱导正常胶质细胞的促炎症因子和趋化因子的转录水平发生不同程度的上调，产生细胞因子级联效应。
　　4.2流感病毒感染星形胶质细胞条件上清液分别刺激原代BALB/C小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞后,皆可抑制细胞活性。
　　4.3流感病毒感染星形胶质细胞条件上清液刺激原代BALB/C小鼠星形胶质细胞后，促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达水平在不同时间点发生不同程度改变，总体呈下降趋势。蛋白质水平上，未能检测出细胞因子级联放大效应，可能与星形胶质细胞促炎/抗炎双向细胞生物学功能有关

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第一章 前言

第二章 材料和方法

2.1实验材料

2.2实验液体配置

2.3实验方法

2.4 统计学方法

第三章 结果

3.1小鼠胶质细胞的分离与培养

3.2 流感病毒PR8(H1N1)和ST602(H3N2)病毒增殖空斑结果

3.3红细胞凝集实验检测条件上清液中流感病毒

3.4 不同时间点条件上清刺激正常胶质细胞诱导细胞因子转录水平上调

3.5 CCK-8检测条件上清对正常神经胶质细胞的毒性作用

3.6 不同时间点条件上清刺激正常星形胶质细胞Western Blotting 检测GFAP表达量的变化

3.7 ELISA检测不同时间点条件上清TNF-α、IL-6、IL-1β含量

3.9Transwell法检测小胶质细胞迁移

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

文献综述

研究生期间发表的论文

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