益母草提取物抑制凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞组织因子表达机制的研究

摘要

组织因子（tissue factor，TF），又称凝血因子Ⅲ（clotting factor III，FIII）或CD142，是一种特异性结合凝血因子 VII（FVII）和活化凝血因子VII（FVIIa）的细胞膜糖蛋白。凝血系统的激活主要依赖于TF的释放及其启动的外源性凝血途径。凝血系统激活是冠心病、缺血性脑血管病、肺栓塞和深静脉血栓等一系列血栓性疾病的重要病理过程。因此抑制TF表达，进而阻止凝血系统活化，是有效防治血栓性疾病重要策略。目前临床上尚缺乏直接抑制 TF的药物。祖国医学中的某些中药具有活血化瘀等抗凝血的功效。初步研究表明，益母草（Leonurus heterophyllus sweet，LHS）能有效地抑制凝血过程，因此我们认为，研究益母草的抗凝血机制是很有价值的。有学者认为，LHS能够有效抑制凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中TF的表达，然而其机制尚不清楚。本论文在发现益母草能够有效抑制凝血酶诱导HUVECs TF表达的基础上，对其可能的信号转导机制进行了探讨。
　　【目的】
　　研究中草药益母草（LHS）提取物抑制凝血酶（thrombin，Thr）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）组织因子（TF）表达的信号转导机制。
　　【方法】
　　萃取法制备（LHS）的水提取物，分离和鉴定 HUVECs。应用 MTT比色法分别确定凝血酶的最适作用终浓度为5 NIH U/ml，LHS提取物的作用终浓度分别为1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1mg/ml。将HUVECs随机分为对照组（只加入等体积的培养基）、Thr处理组（培养基中加入Thr，终浓度为5 NIH U/ml）和四组LHS提取物处理组（各组培养基均加入终浓度为5 NIH U/ml的凝血酶，同时分别加入终浓度为1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1mg/ml的益母草提取物），37℃孵育6小时后收集各组HUVECs。应用Northern blot检测TFmRNA的表达，应用一期凝血法检测TF的促凝活性（TF procoagulant activity，TF:C），应用酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测TF抗原（TF antigen， TF:Ag）的含量，采用流式细胞学方法检测活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase， phospho-p38 MAPK）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酰磷酸化（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶-4、核因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）和蛋白酶激活受体-1（proteinase-activated receptor-1，PAR-1）等信号转导分子的表达。
　　【结果】
　　HUVECs经过Thr处理后，TF mRNA的转录以及TF:C和TF:Ag的表达均比对照组明显增强（与对照组相比，P<0.01）。经过LHS提取物处理后，TF mRNA的转录以及TF:C和TF:Ag的表达均比Thr处理组显著减弱（与Thr处理组相比，P<0.01），而且与LHS提取物的剂量呈依赖关系。另外，流式细胞学检测表明Thr处理组HUVECs细胞中的ROS、phospho-p38 MAPK、NADPH氧化酶-4、NF-κB以及PAR-1等信号转导分子的表达明显增强（与对照组相比，P<0.01），而各LHS提取物处理组HUVECs中的上述各种信号转导分子的表达较Thr处理组呈不同程度的减弱（与Thr处理组相比，P<0.01），并与LHS提取物的剂量呈依赖关系。
　　【结论】
　　LHS可能通过抑制 PAR-1和NADPH氧化酶的激活进而减少凝血酶作用于HUVECs过程中的ROS生成，并通过阻断p38-MAPK磷酸化的活化进一步抑制TF的上游信号调控分子NF-κB的活性，最终抑制凝血酶诱导的TF表达。

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英文缩略词

目录

前 言

材料和方法

一.材料

二.实验方法

实验结果

1. HUVECs鉴定

2. 凝血酶和LHS提取物对HUVECs存活率的影响2.1 凝血酶对HUVECs存活率的影响

3. Northern blot检测mRNA的表达

4. TF:C和TF:Ag的检测结果

讨 论

结 论

参考文献

附录

个人情况简介

致谢