微小RNA-16(microRNA-16)下调表达在心肌肥厚中的作用机制研究

摘要

心肌肥厚是一种常见的心血管疾病,是心肌重构中非常重要的方面,晚期的结局往往会引发心力衰竭或猝死。心肌肥厚分子机制相当复杂,现已证实心肌肥厚的发生与细胞周期调控,钙信号调控等多种信号途径相关,全面揭示心肌肥厚发生的分子机制对于治疗心肌肥厚尤为重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性小片段非编码RNA,可在转录后水平调控靶基因表达,参与细胞的生长、发育、分化和多种疾病的发生发展过程。多个研究证实,miRNAs参与了心肌肥厚的发生过程。
　　微小RNA-16(miR-16)是肿瘤学研究的热点之一。据报道,在慢性淋巴细胞白血病患者中miR-16表达下调,恢复miR-16表达可起到抑制肿瘤的作用。miR-16是心肌组织中中等丰度表达的miRNA,其在心肌肥厚中的作用尚无报道。拟通过腹主动脉缩窄(AAC)手术,制备大鼠心肌肥厚模型,研究miR-16在发生肥厚的大鼠心肌中的表达和在心肌肥厚中的调控作用,并进一步明确调控miR-16表达的信号转导通路。
　　已有研究显示,细胞周期素(Cyclin)在心肌肥厚时表达增强,推动细胞周期由G1向S期转化,进而促进心肌细胞肥大。我们发现,miR-16在心肌肥厚时表达下调,生物信息学分析提示,CyclinD1、CyclinD2和CyclinE1基因的3’UTR存在miR-16潜在的作用位点。本文提出以下科学假设:miR-16下调可促进CyclinD1、CyclinD2和CyclinE1表达,推动细胞周期由G1向S期转化,进而促进心肌细胞肥大。
　　第一部分：大鼠腹主动脉缩窄(AAC)致心肌肥厚模型的制备和鉴定
　　目的：建立因后负荷增加引起的大鼠心肌肥厚模型。方法：选用SD大鼠,体重约220g~250g,随机分四组,即假手术组(Sham)、模型AAC1周(AAC-1w)、AAC2周(AAC-2w)、AAC3周(AAC-3w),每组8只。模型组采用0.3mm的动脉银夹缩窄大鼠的腹主动脉,假手术组只分离腹主动脉,不造成缩窄。利用小动物B超检测心脏结构和功能。通过心肌切片的HE染色,观察心脏形态变化。通过荧光定量PCR检测肥厚早期标志性基因心房利尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的mRNA表达水平。采用Westernblot方法检测ANP和β-MHC的蛋白表达水平。结果：AAC模型组较假手术组大鼠的心脏体积变大,左心室/胫骨长度比显著增加;在AAC-2w和AAC-3w组的大鼠,心室前后壁增大,左室间隔半径缩短;左心室短轴缩短指数(FS％)和左心室射血分数(EF%)均显著降低。ANP、β-MHC的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。结论：采用腹主动脉狭窄法成功建立了由压力后负荷增加引起的大鼠心肌肥厚模型。
　　第二部分：miR-16在心肌肥厚中的表达变化
　　目的：明确大鼠心肌肥厚时miR-16的表达变化。方法：采用荧光定量PCR,检测大鼠肥厚心肌中miR-16的宿主基因SMC4、miR-16前体及miR-16成熟体水平。采用原代分离培养乳大鼠心肌细胞,经苯肾上腺素(PE)处理后,检测ANP、β-MHC、SMC4、miR-16前体及miR-16成熟体表达。结果：成功建立PE诱导的大鼠心肌细胞肥大模型,心肌细胞表面积增大,细胞RNA合成增加,ANPmRNA表达显著上调。在整体心肌肥厚模型和肥大心肌细胞中,一致性地证实SMC4、miR-16前体及miR-16成熟体表达降低。结论：在整体和细胞水平上证实,miR-16在大鼠心肌肥厚时下调表达。
　　第三部分：miR-16对心肌细胞肥大的调控作用
　　目的：观察miR-16表达对心肌肥大表型的影响。方法：原代分离乳大鼠心肌细胞,利用脂质体转染Negative Control(NC)、miR-16mimics、miR-16inhibitor,利用荧光定量PCR和Western blot检测ANPmRNA和蛋白表达,利用FITC-鬼笔环肽染色显示心肌细胞中Factin表达,EU染色显示新合成RNA,用激光共聚焦显微镜观察心肌细胞形态,利用IPP软件测量细胞表面积。结果：与转染NC组相比,miR-16 mimics可抑制PE诱导的心肌细胞中ANP表达上调,以及心肌细胞表面积和新合成RNA的增加。与感染rAd-GFP对照病毒相比,感染重组miR-16病毒(rAd-miR-16)可显著抑制PE诱导的心肌细胞中ANP表达升高,以及心肌细胞表面积和新合成RNA的增加。而转染miR-16 inhibitor可引起乳大鼠心肌细胞出现肥大表型。结论：miR-16参与调控了心肌细胞肥大过程。
　　第四部分：介导miR-16调控心肌细胞肥大的靶基因鉴定
　　目的：鉴定介导miR-16调控心肌细胞肥大的靶基因。利用Target Scan等生物信息学软件预测miR-16作用的靶基因。荧光定量PCR和Western blot检测miR-16靶基因的mRNA和蛋白表达水平。FITC-鬼笔环肽染色显示心肌细胞表面积。结果：miR-16可靶向作用三个与细胞周期调控相关的CCND1、CCND2、CCNE1基因,在发生肥厚的大鼠心肌组织和PE诱导肥大的大鼠心肌细胞中,上述细胞周期蛋白表达升高,过表达miR-16的可降低心肌细胞中CCND1、CCND2和CCNE1的蛋白水平,但对它们的mRNA水平没影响。分别沉默CCND1、CCND2、CCNE1表达可显著抑制PE引起的心肌细胞肥大表型。结论：CCND1、CCND2、CCNE1介导了miR-16对心肌细胞肥大的抑制作用。
　　第五部分：调控心肌肥厚时miR-16表达的信号通路研究
　　目的：探讨Stat3/c-Myc信号通路在调控miR-16下调表达中的作用。方法：采用Western blot方法检测肥厚的大鼠心肌组织及PE诱导肥大的大鼠心肌细胞中p-Stat3、Stat3、p-c-Myc、c-Myc蛋白水平。分别利用相应的Stat3、c-Myc抑制剂处理大鼠心肌细胞,通过荧光定量PCR检测miR-16成熟体的表达水平。结果：p-Stat3、p-c-Myc蛋白水平在AAC诱导肥厚的大鼠心肌组织和PE处理的乳大鼠心肌细胞中显著上调;p-Stat3、p-c-Myc的抑制剂均能明显升高大鼠心肌细胞中miR-16表达。结论：心肌肥厚时Stat3/c-Myc信号通路激活,并负调控了心肌中miR-16的表达。
　　全文总结:本文在心肌组织和细胞水平上证实,心肌肥厚时miR-16成熟体、miR-16前体及宿主基因SMC4表达降低。增加miR-16表达可抑制PE引起的心肌细胞肥大表型,而抑制miR-16表达就可引起心肌细胞出现肥大表型。荧光定量PCR和Western blot结果证实,miR-16可在转录后水平调控CCND1、CCND2和CCNE1的表达。在心肌肥厚时,Stat3/c-Myc信号通路激活并调控了miR-16的表达下调。miR-16表达降低解除了对细胞周期蛋白CCND1、CCND2和CCNE1的抑制作用,进一步使CCND1、CCND2和CCNE1作用增强,促进心肌细胞G1/S期转化和心肌细胞肥大。本文研究结果提示,miR-16可能是进行心肌肥厚治疗研究的重要靶点。

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前言

第一章 大鼠腹主动脉缩窄(AAC)致心肌肥厚模型的制备和鉴定

1.材料

2.方法

3.结果

4.小结

第二章 miR-16在心肌肥厚中的表达变化

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 小结

第三章 miR-16对心肌细胞肥大的调控作用

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 小结

第四章 介导miR-16调控心肌细胞肥大的靶基因鉴定

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 小结

第五章 调控心肌肥厚时miR-16表达的信号通路研究

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 小结

讨论

全文总结

参考文献

文章发表情况

致谢

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