尾加压素II受体介导同型半胱氨酸刺激血管外膜成纤维细胞增殖及迁移作用

摘要

背景及目的：高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）作为一种新的心血管危险因素，与血管重塑(Vascular remodeling)这一病理生理过程的发生发展有着密切的关系。血管重塑的过程受到多种因素的影响，尾加压素II（Urotensin II，UII）作为一种缩血管活性肽，参与了血管重塑的发生和发展。本课题组前期在HHcy合并主动脉球囊损伤大鼠模型上，发现HHcy促进损伤血管内膜增生同时，新生内膜组织上UII及其受体GPR14（Urotensin II receptor，UT）的蛋白及基因表达水平增加。然而，同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)和UII及其受体之间的直接作用尚未阐明。为此，本课题在离体培养的大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts，AFs)上，研究了Hcy对UII及其受体GPR14表达的调控作用，并探讨了UII及其受体是否介导了Hcy刺激AFs增殖及迁移作用。
　　方法：大鼠主动脉血管外膜成纤维细胞体外培养采用组织贴块法，实验使用3到5代细胞，无血清RPMI-1640培养基同步化培养24小时，然后按下述方案进行：
　　（1）在AFs培养液中分别以浓度（0~300μmol/L）和时间（0~48h）梯度方式加入外源性Hcy刺激，采用蛋白免疫印迹试验法（Western blot）测定细胞GPR14表达的变化；制作细胞爬片，采用免疫细胞化学法测定细胞内UII的表达变化；
　　（2）在培养液中预先加入UII受体阻断剂Urantide(10-6mol/L)，干预UII受体，再加入Hcy刺激48h，分别采用BrdU掺入法检测细胞增殖，Transwell法检测细胞迁移能力。
　　结果：
　　1. Hcy可促进AFs表达UII受体GPR14。不同浓度UII刺激细胞后，30μmol/L、100μmol/L和300μmol/L Hcy刺激组细胞GPR14蛋白表达分别较对照组增加150.30％（P>0.05）、200.24%（P>0.05）和265.96%（P<0.05）。Hcy（浓度300μmol/L）分别刺激细胞12h、24h和48h后，GPR14蛋白表达较对照组分别增加22.39%（P>0.05）、121.97%（P>0.05）和168.05%（P<0.05），表明Hcy以浓度及时间依赖性方式促进细胞GPR14表达。
　　2. Hcy可明显促进AFs表达U II。采用免疫细胞化学法检测表明，对照组可见少量UII表达，而在Hcy处理组表达呈强阳性，明显高于对照组（P<0.001）。
　　3. Hcy促进AFs增殖及迁移的作用能够被UII受体拮抗剂Urantide所抑制。Hcy刺激组细胞增殖及迁移水平较对照组分别增高45.91%（p<0.01）和79.06%（p<0.01），而Hcy+Urantide组细胞的增殖及迁移水平较Hcy刺激组降低58.67%（p<0.001）和30.54%（p<0.01）。
　　结论：同型半胱氨酸可促进大鼠主动脉外膜成纤维细胞U II及其受体GPR14表达；U II受体介导了同型半胱氨酸促进大鼠主动脉外膜成纤维细胞增殖及迁移的作用。

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第一章 前言

第二章 实验设计

第三章 材料与方法

3.1实验动物

3. 2主要药物、试剂及器材

3.3主要溶液的配制

3.4 Afs原代细胞培养

3.5 免疫印迹(Western-Blotting)

3.6 免疫细胞化学

3.7 细胞迁移（Transwell）

3.8细胞增殖（BrdU掺入法）

3.10数据处理及分析

第四章 实验结果

4.1血管外膜成纤维细胞的培养

4.2 不同浓度的Hcy处理对AFs 表达GPR14 的影响

4.3 Hcy处理不同时间对AFs 表达U II 受体GPR14 的影响

4.4 Hcy刺激对AFs 表达UII的影响

4.5 UII 受体阻断剂 Urantide 对Hcy 刺激 AFs迁移作用的影响

4.6 UII 受体阻断剂 Urantide 对Hcy 刺激 AFs增殖作用的影响

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

附录一

附录二 个人简历