CIAKI大鼠肾损害fMRI评价及AQP表达水平关联研究

摘要

【目的】
　　（1）研究血氧水平依赖成像(blood oxygenation-level dependent, BOLD)及动脉自旋标记灌注成像（arterial spin labeling, ASL）技术在评价正常及对比剂急性肾损害（Contrast induced acute kidney injury, CIAKI）状态下大鼠肾血流量及氧含量动态变化的应用价值；并进一步比较BOLD联合ASL与血清肌酐（serum creatinine, Scr）对CIAKI的诊断效能；
　　（2）探讨CIAKI大鼠肾组织水通道蛋白（aquaporins, AQP）1-4表达水平，分析AQP1-4在CIAKI病理生理机制中所起作用；
　　（3）通过比较分析BOLD与AQP1-4表达水平，进一步探讨肾内氧含量及血流量变化与AQP表达水平之间的相关性，以期为临床有效监测CIAKI发生发展提供一种较为客观的影像学评估方法及监测指标。
　　【材料与方法】
　　1．实验动物及仪器
　　本研究共购买24只SD雄性大鼠，体重为229.21±15.45g，所有大鼠均来自中山大学动物实验中心，并饲养于标准条件下。本研究动物实验伦理通过广东省人民医院（广东省医学科学院）医学研究伦理委员会伦理审核不违反动物实验伦理原则。所有大鼠MRI扫描均采用通用电气公司的Signa Excite3.0T超导型全身磁共振扫描仪(General Electric,GE,Milwaukee,WI)。标准50mmbirdcage实验专用动物线圈，体位为头先进、仰卧位；采用腹部填塞法固定实验大鼠。分别于注射对比剂前24 h及注射对比剂后30min、12h、24h、48h、72h和96h对大鼠进行MRI扫描，扫描前常规禁食禁水4小时以上。注射对比剂前扫描组作为对照组。所有动物均采用腹腔注射20％乌拉坦（6ml/kg）进行麻醉，麻醉后经尾静脉注射离子型碘对比剂（复方泛影葡胺注射液,370mg/ml,6ml/kg）。
　　2．MRI扫描
　　MRI扫描序列包括常规轴位T1WI、轴位及冠状位T2WI成像序列，以及ASL-FAIR-SSFSE和BOLD-MFGRE功能成像序列，各序列成像参数分别为：
　　（1）FSE-XL/T1WI序列：轴位，扫描模式=2D，Grad Mode=zoom，TR=500ms，TE=13.3ms，翻转角=90°，带宽=15.6HZ，NEX=4.0，FOV=10.0cm×7.0cm，层厚=2.0mm，层距=0.2mm，矩阵=288×192，ET=3，扫描时间=94s。
　　（2）FSE-XL/T2WI序列：轴位及冠状位，扫描模式=2D，Grad Mode=zoom，TR=4500ms，TE=125.8ms，带宽=62.50HZ，NEX=6.0，FOV=10cm×7.5cm，层厚=2.0mm，层距=0.2mm，矩阵=288×192, ET=19，扫描时间=443s。
　　（3）ASL-FAIR-SSFSE序列：冠状位，扫描模式=2D，Grad Mode=zoom，TR=2453ms，TE=119.8ms，带宽=83.3HZ，FOV=10.0cm×10.0cm，层厚=2.0mm，Sap=0.2mm，矩阵=128×128，ET=19，层数=4层，扫描时间=159s。
　　（4）BOLD-MFGRE序列：冠状位，扫描模式=2D，Grad Mode=zoom，TR=100ms，TE=4.0ms，带宽=31.3Hz，FOV=10.0cm×10.0cm，层厚=2.2mm，层距=0.2mm，矩阵=96×96，ET=19，层数=4层，扫描时间=78s。
　　3．图像分析及后处理
　　由2名经验丰富的MR诊断医师分别分析各成像序列采集所得图像质量，主要从图像解剖结构显示情况、信噪比、分辨率、对比度以及伪影等方面分析。并将BOLD及ASL功能成像序列所得图像传送至GE公司提供的ADW4.3工作站，功能重建选择Functool软件处理和主机配备的T2*map以及FAIR后处理软件，可测量出T2*及肾血流量（renal blood flow, RBF）值，自旋-自旋驰豫（去相位）率R2*值则根据公式：R2*=1/T2*获得。在图像质量较好的右肾皮质、外髓、内髓各层结构的上下极及肾门水平分别选取感兴趣区（region of interest,ROI），每个ROI大小、形状完全相同。ROI大小约2.5mm2～5.0mm2，每个ROI至少包含5个像素。测量选择的层面无变形或伪影，避开大血管。
　　4．病理学检查方法
　　每个时间点取3只大鼠，扫描结束后将大鼠处死，解剖采集下腔血清标本以及肾脏标本。将血清离心后取上清液测肌酐值，将肾脏标本保存于10%福尔马林溶液中固定，后进行切片，染色，并分别于100、200倍光学显微镜下观察测量灰度值。其中免疫组织化学染色方法步骤如下：
　　(1)组织固定：福尔马林溶液固定，脱水，包埋及切3mm厚切片；
　　(2)标本脱蜡：二甲苯I、II各30 min；100％酒精I、II各5 min、95％酒精I、95％酒精II各5 min；80％酒精5 min；PBS及蒸馏水各3遍，每遍洗5 min；
　　(3)阻断：3％过氧化氢孵育25 min，PBS洗3遍，每遍5 min；
　　(4)封闭：每片组织片上滴50μl正常羊血清，室温孵育20 min；
　　(5)一抗：去除多余血清后分别滴加单抗（AQP1-4），50μl/片，室温1h，PBS5min×3；
　　(6)二抗：滴加羊抗鼠IgG，50μl/片，37℃30 min，PBS洗3遍，每遍5 min；
　　(7)滴加辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)标记的亲和素，50μl/片，37℃30 min，PBS洗3遍，每遍5 min；
　　(8)DAB显色，视显色强度而定时间；
　　(9)蒸馏水终止反应后行苏木素复染核；
　　(10)盐酸酒精分化,氨水返兰；酒精脱水，树胶封片；
　　(11)电子显微镜下观察肾组织AQP1-4蛋白表达情况。
　　5．统计学方法
　　应用SPSS13.0统计软件，数据采用均数±标准差方式表示，各时间点大鼠肾各层结构R2*、RBF、血肌酐值及AQP灰度值组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），各组间两两比较采用最小显著差值法（Least-significant Differennce, LSD）；非正态分布或方差不齐采用符号秩和检验；P<0.05定义为差异有统计学意义。由两名测量者分别测量R2*、RBF值的可重复性采用组内相关系数（Intraclass correlation coefficient, ICC）分析。
　　【结果】
　　1．实验大鼠结果及图像质量分析
　　24只SD雄性大鼠，其中三只在完成72 h扫描后死亡，共获得对照组、注射碘对比剂后30 min、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h组例数分别为6、6、6、6、6、6和3例。T2WI序列采集获得图像质量最好，对比度最好，肾脏各层组织结构显示最清晰。ASL及BOLD序列图像质量较好，能较清晰显示肾脏皮质、内髓、外髓各层结构；满足图像分析的需要。
　　2．统计结果
　　（1）各组大鼠肾皮质、外髓、内髓各层结构前后两次测量R2*及RBF值的一致性检验采用组内相关系数分析。肾脏皮质、外髓、内髓R2*值前后两次测量值的ICC值分别为0.824、0.825和0.850；肾脏皮质、外髓、内髓RBF值前后两次测量值的ICC值分别为0.821、0.786和0.720。前后两次测量各层结构的ICC值均大于0.7，说明一致性较好，进一步证实BOLD及ASL成像序列的可重复性较好。
　　（2）各组间RBF值检验：经正态性检验分析肾皮质各组数值分布符合正态性分布，但方差不齐；肾外髓及内髓48 h组数据均为非正态性分布。用符号秩和检验分析肾皮质组间2=16.686，P=0.011；肾外髓组间2=12.945，P=0.044；肾内髓组间2=8.813，P=0.184。进一步用Bonferroni及确切概率法对肾皮质及外髓各组间数据进行两两比较，发现与对照组相比肾皮质与肾外髓12 h、24 h、48 h、72 h组RBF值明显低于对照组（P<0.05），30min及96h组RBF值差异无统计学意义（P>0.05）。
　　（3）各组间R2*值检验：经正态性检验分析肾内髓及肾外髓各组数值分布符合正态性分布，方差齐；肾皮质及外髓数据均为非正态性分布。用One-way ANOVA分析肾内髓各组间R2*值F=2.024，P=0.09；肾外髓组间R2*值F=61.093，P=0.000。用秩和检验分析肾皮质各组间R2*值2=11.201，P=0.082。进一步用LSD法对肾外髓各组间数据进行两两比较，发现与对照组相比肾外髓30 min、12 h、24h、48h、72 h组R2*值明显高于对照组（P<0.05），96h组R2*值差异无统计学意义（P>0.05）。
　　（4）各组间血肌酐值检验：经正态性检验分析各组血肌酐值分布符合正态性分布，方差齐；用One-way ANOVA分析各组血肌酐值F=7.660，P=0.000；进一步用LSD法对各组进行两两比较，发现仅72 h组血肌酐值明显高于对照组（P<0.05）；余各时间点血肌酐值与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。
　　（5）各组间AQP1-4值检验：经正态性检验分析各组AQP1-4表达情况灰度值分布符合正态性分布，经One-way ANOVA方差分析得出各时间点AQP1-4存在差异（F=9.656、6.024、21.693、24.303，P<0.05），进一步采用LSD两两比较检验，AQP1-2灰度值12 h至72 h组较对照组明显升高（P<0.05）；AQP3灰度值仅48 h组高于对照组（P<0.05）；AQP4灰度值各时间点均较对照组高（P<0.05）。用Pearman相关性检验分析肾外髓AQP1-4表达情况与R2*值相关性，结果显示AQP1与AQP2表达情况与R2*值呈正相关，相关系数r分别为0.531（P=0.023）、0.471（P=0.049）；而AQP3及AQP4灰度值与R2*相关性未达到统计学意义（P>0.05）。
　　【结论】
　　1．通过MRI大鼠肾脏ASL及BOLD成像技术获得RBF及R2*值具有较好的可重复性，可客观反应CIAKI大鼠肾血流量及含氧量的变化，可作为CIAKI的评价手段。
　　2．ASL成像技术在注射对比剂后12 h即能发现RBF值明显降低，BOLD成像技术在注射对比剂后30 min即能发现R2*明显升高，Scr在注射对比剂后72 h可发现明显升高；ASL及BOLD能较Scr更早监测出CIAKI发生发展情况，可作为CIAKI的监测手段。
　　3．BOLD成像技术测得肾外髓R2*值在注射对比剂后30 min、12 h、24 h、48 h、72 h明显高于对照组；AQP1-2值在注射对比剂后12 h至72h明显高于对照组，AQP4值在注射对比剂后各时间点均高于对照组。R2*值与AQP1及AQP2表达情况呈正相关关系，BOLD有可能成为AQP表达情况的预测指标。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

前言

材料与方法

一、实验动物

二、实验设备及用品

三、MRI成像扫描

四、病理检查

五、图像后处理与数据分析

结果

一、MRI扫描结果及图像数据分析

二、血清肌酐值测量及统计分析

三、R2*、RBF与血肌酐对CIAKI监测价值比较

四、病理检查结果

讨论

一、ASL-fMRI成像对CIAKI肾血流量变化评价研究

二、BOLD-fMRI成像对CIAKI肾氧含量变化评价研究

三、ASL联合BOLD-fMRI成像对CIAKI肾损害情况评价研究

四、比较ASL联合BOLD-fMRI成像与血肌酐值对CIAKI肾损害情况评价效能研究

五、BOLD-fMRI成像与AQP表达情况关联研究

全文总结

研究的创新与不足

参考文献

致谢

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