热应激联合脂多糖对人血单核细胞功能活性和表面分子的影响

摘要

实验目的：
　　中暑是一种严重威胁人民健康和生命的疾病，主要表现为高体温（超40℃），而重症中暑表现为以中枢神经系统功能障碍（伴有惊厥、谵妄、昏迷）为突出表现的多脏器功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。尽管临床上采取积极的降温并实施积极的脏器支持，但重症中暑的生存率仍没有很大的改善。本研究以人血单核细胞作为研究对象，通过热应激联合脂多糖刺激体外模拟重症中暑，观察人血单核细胞活性功能和表面分子变化，探索分析重症中暑炎症反应的发生机制为重症中暑的临床救治提供可能的指导方向。
　　实验方法：
　　①实验对象为人外周血经过ficoll密度梯度离心法分离并贴壁培养后获得的人血单核细胞。
　　②建立热应激联合脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）双重打击人血单核细胞模型：人血单核细胞于43℃细胞培养箱培养30分钟后，再用500ng/mLLPS刺激培养12小时。
　　③热应激联合LPS双重打击人血单核细胞功能活性检测：ELISA检测细胞培养上清中炎症介质含量白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）。
　　④DCFHDA探针荧光染色后流式细胞仪检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS）水平；使用吞噬荧光微球法，荧光显微镜下观察吞噬荧光微球的人血单核细胞，流式细胞仪检测吞噬荧光微球数目。
　　⑤热应激联合LPS双重打击人血单核细胞表面分子表达检测：流式细胞仪检测细胞表面分子，包括CD86、髓系细胞触发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1)和 Toll样受体4(Tolllikereceptors4,TLR4)；实时定量聚合酶链反应(Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)检测TREM-1和TLR4的mRNA水平；蛋白质免疫印迹(western blot，WB)检测TREM-1和TLR4蛋白水平的表达。
　　实验结果：
　　①热应激联合LPS刺激升高人血单核细胞培养上清中TNF-α、IL-1β及IL-10浓度，增强人血单核细胞炎症分泌活性。
　　②热应激联合LPS刺激增加人血单核细胞内活性氧簇（ROS）表达，增强人血单核细胞氧化分泌活性。
　　③热应激打击抑制人血单核细胞吞噬功能，较单纯热应激打击，热应激联合LPS对人血单核细胞吞噬功能抑制作用更为明显。
　　④热应激联合LPS刺激降低人血单核细胞表面分子CD86表达率，增加人血单核细胞表面分子TREM-1和TLR4表达率。
　　⑤热应激联合LPS刺激增加人血单核细胞表面分子TREM-1和TLR4蛋白和mRNA表达水平。
　　结论：
　　热应激联合LPS刺激增强人血单核细胞炎症氧化分泌活性、抑制吞噬功能，其机制与热应激联合LPS刺激下调人血单核细胞表面分子CD86表达并上调TREM-1和TLR4表达相关。

目录

声明

第一章 研究背景

第二章 研究方法及结果

1.1人血单核细胞原代分离培养

1.1.1人外周血标本的获取

1.1.2主要设备和仪器

1.1.3试剂及配制

1.1.4实验步骤

1.2建立热应激联合LPS打击人血单核细胞模型

1.2.1主要设备和仪器：

1.2.2试剂及配制

1.2.3实验步骤：

1.3热应激联合LPS双重打击人血单核细胞活性和功能的检测

1.3.1ELISA检测人血单核细胞培养上清中炎症介质浓度（IL-1β、TNF-α及IL-10含量）

1.3.2 DCFHDA探针荧光染色后流式细胞仪检测培养细胞内活性氧簇（ROS）水平

1.3.3 使用吞噬荧光微球法，荧光显微镜下观察吞噬荧光微球的人血单核细胞，流式细胞仪检测人血单核细胞吞噬荧光微球数目。

1.3.4统计学分析

1.3.5实验结果

1.4热联合LPS双重打击人血单核细胞表面分子的检测

1.4.1流式细胞仪检测细胞表面分子，包括CD86、TREM-1和TLR4

1.4.2Western blog检测TREM-1和TLR4蛋白水平的表达

1.4.3RT-PCR检测TREM-1和TLR4的mRNA表达水平

1.4.4统计学分析

1.4.5实验结果

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

研究生期间取得的成绩

主要英文缩略词索引

致谢