INK4/ARF基因簇多态性和甲基化与中国汉族人群冠心病的关联研究

摘要

目的：本研究以中国汉族人群为研究对象，首次系统分析了INK4/ARF基因簇长链非编码基因（ANRIL）在汉族人群的突变情况，探讨这些突变位点与冠心病的相关性；并对INK4/ARF基因座启动子区域的DNA甲基化进行检测，探讨DNA甲基化与冠心病及基因突变的关系。
　　方法：收集经冠脉造影判断的795例冠心病患者、544例非冠心病对照，采用Fluidigm192.24芯片技术对 ANRIL基因18个候选多态性位点进行检测；另挑选临床指标匹配的冠心病组（63例）和对照组（37例），采用焦磷酸测序方法对ANRIL、P14ARF和P15INK4b基因启动子区域的CpG岛进行DNA甲基化检测。
　　所得资料经整理后，用Excel建立数据库，数据导入SPSS19.0软件（SPSS Inc.）进行分析。采用1-Sample K-S检验进行连续性变量的正态性检验，并采用t检验比较组间差异；计量资料用均数±标准差来表示。分类资料组间比较以及各个 SNPs的Hardy-Weinberg平衡检验均采用卡方检验或Fisher确切概率（Fisher’sexact test）法进行分析。采用多元非条件 Logistic回归分析各基因型与冠心病发病风险的关系，校正年龄、性别、吸烟、饮酒、血压、血糖和血脂（甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇）等传统冠心病危险因素，计算OR值和95％置信区间。
　　结果：
　　（1）病例组年龄、男性比例、吸烟比例以及高血压、糖尿病和血脂异常的发病率均高于对照组。
　　（2）经初步分析，ANRIL tag SNPsrs10811647，rs4977756，rs10757269，rs9632885， rs1004638，rs1333048和rs1333050与冠心病有显著性关联。
　　（3）经多元Logistic回归模型校正年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病和血脂异常等因素后，ANRIL tag SNPs rs1004638，rs1333048和rs1333050与冠心病有显著性关联。rs1004638的AT基因型（校正后OR=2.13，95%CI=1.34-3.40，P=1.41×10-3）、AA基因型（校正后 OR=2.50，95%CI=1.58-3.95，P=9.66×10-5），rs1333048的AC基因型（校正后 OR=1.38，95%CI=1.01-1.88，P=4.43×10-2）、CC基因型（校正后 OR=2.02，95%CI=1.40-2.91，P=1.63×10-4），以及 rs1333050的 TT基因型（校正后 OR=1.58，95%CI=1.09-2.28，P=1.54×10-2）均能显著增加冠心病的发病风险。由SNPrs1004638和rs1333048构建的单倍型分析结果显示，A-C单体型患冠心病的危险性显著性增加。
　　（4）rs1004638和rs1333050与年龄小于65岁人群的冠心病发病率均有显著性关联，与年龄大于等于65岁人群的冠心病发病率均无显著性关联；rs1333048与两个年龄组人群的冠心病发病率均有显著性关联。rs1333048和rs1333050不同基因型在早发型冠心病患者（发病年龄小于65岁）和迟发型冠心病患者（发病年龄大于等于65岁）间的分布差异均有统计学意义。
　　（5）rs1004638、rs1333048和rs1333050与男性的冠心病发生率均有显著性关联，而与女性的冠心病发生率均无显著性关联。
　　（6）rs1333048与血脂异常相关，而与高血压、糖尿病无显著性关联；rs1004638和rs1333050与血脂异常、高血压及糖尿病之间均不存在显著性关联。
　　（7）ANRIL基因多态性（rs1333048）与冠心病的发病率及冠脉病变狭窄程度相关。从AA型到AC型、再到CC型，随着风险位点个数增加，冠心病发病率逐渐上升，分别为51.70%、58.75%和68.67%；反映冠脉狭窄程度Gensini评分逐渐增加，分别为32.80、33.80和47.60；多只血管病变（2只或3只）的发生率也逐渐增加，分别为60.90%、64.88和77.14%。
　　（8）冠心病易感性ANRIL基因多态性位点（rs1004638、rs1333048和rs1333050）与CAD患者心电图ST段改变均无显著性关联；与再次PCI术或支架内再狭窄均无显著性关联；与冠脉分布类型均无显著性关联。
　　（9）ANRIL、P14ARF和P15INK4b基因启动子区域甲基化程度均处于较低水平。
　　（10）ANRIL和P14ARF基因启动子区域DNA甲基化水平在病例组和对照组之间均无显著性差异，P15 INK4b基因启动子区域有一个位点（pos3）DNA甲基化水平在病例组和对照组之间有差异，病例组甲基化程度高于对照组。
　　（11）在女性人群，病例组P15INK4b甲基化程度高于对照组；在男性人群，病例组与对照组P15INK4b甲基化程度无明显差异。
　　（12）与冠心病相关联的rs1004638与ANRIL的甲基化有关，在pos4和pos8位点， AA、AT基因型甲基化程度高于TT型；rs1333048，rs1333050对ANRIL的甲基化水平无影响。与冠心病相关联的SNP rs1004638，rs1333048，rs1333050对P15INK4b基因的甲基化水平没有影响。
　　结论：本研究首次系统、全面对 ANRIL基因多态性与中国汉族人群冠心病进行关联分析，发现ANRIL基因多态性(rs1004638, rs1333048和rs1333050)与中国汉族男性冠心病的发生有显著性关联，其中 rs1333048还与冠脉狭窄的严重程度（Gensini评分）和受累冠脉血管数量显著相关。首次发现rs1333048与冠心病和血脂异常都有关联，ANRIL与冠心病的易感性可能与血脂异常有关。INK4/ARF基因座甲基化与冠心病和ANRIL基因多态性均有显著性关联，但在冠心病的发生、发展过程中，ANRIL对INK4/ARF基因表达的调控作用可能超过甲基化方式。

目录

声明

缩略词表

引言

1 冠心病概述

2冠心病的诊断

3冠心病的分子遗传学研究进展

4DNA甲基化

5 立题思路

第一部分潮汕生物样本库的建立

1研究对象及方法

2样本库基本信息

3样本库特色

4讨论

第二部分ANRIL基因多态性与中国汉族人群冠心病的关联研究

1 研究对象

2 研究方法

3研究结果

4讨论

5 小结

第三部分INK4/ARF基因甲基化与冠心病的关联研究

1研究对象

2 研究方法

3研究结果

4讨论

5小结

本研究的创新之处

参考文献

附录1

附录2

附录3

附录4综述：长非编码RNA(lncRNA)与心血管疾病

附录5个人简历

致谢