细胞黏附分子L1与动力蛋白Dynamin1相互作用调控阿尔兹海默症发病机制

摘要

背景：阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease，AD）是一种持续性神经退行性疾病。AD的病因主要是由于可溶性的单体淀粉样蛋白β（amyloid beta，Aβ）片段聚集，导致原纤维沉积，最终形成淀粉样斑块。L1神经细胞黏附分子（L1 cell adhesion molecule，L1）是200-220 kDa跨膜糖蛋白，含有六个免疫球蛋白（Ig）样结构域和五个纤连蛋白III型重复，以及单通道跨膜区和胞内结构域（L1 intracellular domain，L1-ICD）。前期研究发现，当L1在神经元和神经胶质中过表达时，可显著降低AD小鼠的病理症状，提示L1可能在缓解AD症状中具有重要的生物学功能。动力蛋白Dnm1（Dynamin1）是一种100 kDa的GTP水解酶，参与网格蛋白介导的内吞作用与囊泡循环。先前的研究发现抑制Dnm1的表达可以显着降低N2a-APP695细胞中的Aβ表达水平。表明Dnm1在AD进展中发挥重要作用。因此，我们推测L1可能与Dnm1通过组成蛋白质复合体参与调控Aβ表达水平。研究L1和Dnm1在AD发病进程中的相互作用，及其对Aβ表达水平的调控机制，可以为L1/Dnm1作为潜在的AD临床治疗手段提供理论依据。
　　目的：研究L1和Dnm1在AD病理过程中的相互作用。
　　方法：首先我们利用免疫共沉淀和质谱分析推测可能与L1-ICD结合的分子，结果显示在小鼠脑组织中，L1可能与Dnm1存在相互作用。我们进一步利用免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜分别检测两者在HEB细胞和U-87 MG细胞中的表达定位情况。同时，我们利用免疫共沉淀技术和GST pull-down分别在体内和体外验证L1与Dnm1的结合。为了表达GST-L1-ICD和Dnm1功能域重组蛋白，我们构建了质粒pET-32a-Dnm1-full-length，pET-32a-Dnm1-GTPase，pET-32a-Dnm1-MID，pET-32a-Dnm1-PH，pET-32a-Dnm1-GED，pET-32a-Dnm1-PRD，以及pGEX-5X-1-L1-ICD，进而在原核表达系统中表达出GST-L1-ICD，His-Dnm1-GTPase，His-Dnm1-MID，His-Dnm1-PH，His-Dnm1-GED，His-Dnm1-PRD，His-Dnm1-full length，随后通过GST pull-down实验确定L1与Dnm1相互作用结构域。之后我们利用免疫印迹检测过表达Dnm1后N2a细胞中APP的表达水平。免疫组化试验检测AD小鼠中L1与Dnm1的变化情况。
　　结果：我们的研究结果显示L1和Dnm1在神经细胞中存在共定位。体内和体外研究结果表明L1可以通过其细胞内结构域直接与Dnm1相互作用，进一步研究发现Dnm1可以通过Dnm1-GTPase蛋白质结构域直接与L1-ICD结合。在过表达Dnm1的N2a细胞中，可检测到APP蛋白表达水平降低。与野生型相比，在AD小鼠海马CA1区中L1蛋白水平升高，Dnm1水平降低。进而L1和Dnm1可能组成一个蛋白质复合体在AD发生过程中调节Aβ的表达水平。
　　结论：L1和Dnm1通过L1-ICD和Dnm1-GTPase结构域直接相互作用组成蛋白质复合体，可能在AD发生过程中调节Aβ的表达水平。这一机制的阐释对L1应用于AD临床治疗，改进AD治疗手段，都具有非常重要的意义。

目录

声明

第一章 引言

第二章 材料与方法

2.1.1主要耗材

2.1.2主要试剂及试剂盒

2.1.3主要仪器

2.1.4主要试剂配制

2.2实验方法

2.2.1小鼠脑组织样本收集

2.2.2免疫共沉淀

2.2.3蛋白质免疫印迹（Western blot）

2.2.4细胞培养

2.2.5免疫荧光染色

2.2.6 L1及Dnm1的功能域PCR扩增

2.2.7琼脂糖凝胶电泳

2.2.8 DNA片段回收

2.2.9双酶切反应

2.2.10目的片段与载体连接

2.2.11大肠杆菌感受态的制备

2.2.12连接产物转化

2.2.13菌落PCR鉴定阳性克隆

2.2.14质粒提取

2.2.15蛋白质表达

2.2.16 His标签蛋白纯化

2.2.17 GST标签蛋白纯化

2.2.18 GST pull-down实验

2.2.19细胞转染

2.2.20小鼠脑组织石蜡切片制备

2.2.21免疫组化染色

2.2.22免疫阳性细胞信号光密度值统计方法

第三章 实验结果

3.1 L1胞内段与Dnm1相互作用

3.2 L1与Dnm1的结构域示意图

3.3 PCR扩增

3.4重组质粒的菌液PCR 鉴定

3.5 测序鉴定

3.6 L1胞内段可直接结合于Dnm1的GTPase结构域

3.7过表达Dnm1可降低APP蛋白表达水平

3.8 L1和Dnm1免疫组化染色

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

附录I 运用DNAStar中的SeqMan软件分析各个质粒的测序结果

缩略词

致谢

个人简历