三维组织学重建技术研究睾丸的下降过程

摘要

目的：
　　睾丸是生殖系统的重要器官，胚胎期其发育经历了形态、结构、功能及位置等系列变化，与整个泌尿生殖系统特别是外生殖系统的形态、结构、功能等发育（畸形、异常等）密切相关，近年来，随着“睾丸发育不全综合征”（testicular dysgenesis syndrome, TDS）以及“成人疾病胎源/发育源学说”（Fetal Origin of Adult Disease, FOAD）和“健康与疾病的发育源说”（Developmental Origins of Health and Disease, DOHAD）等研究的逐步深入，胚胎期睾丸发育的研究显得越来越重要。胚胎期睾丸的正常发育需要伴随正常的下降过程，反之，如果下降过程异常则发育必然受到影响。因此睾丸下降过程及其影响因素也是研究睾丸发育的重要方面。既往，在这方面比较集中的是对睾丸下降调控机理的研究，而对睾丸下降发育的相关结构研究则很不够。事实上，胚胎期的睾丸是一个与诸多毗连或相邻结构密切关联的器官，比如其头侧的悬韧带、尾侧的引带，周围的腹股沟管结构以及直到生后并伴随终生的附睾、鞘膜等。提示睾丸的下降发育涉及多种组织、结构，是一个相当复杂的过程，特别是在胚胎发育期这些组织结构的形态、位置随时间不断变化、移位，甚至消失，更给相关研究带来很大困难。致使既往不少研究结果及资料大多是局部的和某个特定时间点的，未能给出个整体的、综合的、纵向时序性的印象及结论。基于此，本研究探索运用三维组织学重建技术（3D histology reconstruction），在显微组织学水平重建出睾丸下降发育的几个重要时间点的泌尿生殖系统重要结构，希望能把睾丸、附睾、引带及膀胱等作为一个密切关联的整体进行研究，通过观察正常及经典外源性雌激素（EEs）己烯雌酚（DES）实验影响条件下，它们的形态变化及位置关系，从立体形态学的角度研究睾丸下降的大致过程及其毗邻和影响关系,为进一步的发育及影响—效应研究提供基础。
　　方法：
　　⑴取以上正常组 GD15、GD17、GD19胎鼠及 PD3、PD7仔鼠和对照组、实验组 GD19胎鼠以20μm厚度行连续切片，切片间隔取片后行HE染色，封片后按顺序拍摄、存储，借助 photoshop软件将图片配准，运用3D-doctor软件进行三维重建，并对图像进行研究分析。⑵取以上正常组GD19胎鼠以10μm厚度行连续切片，切片间隔取片后行免疫组化S100法处理，封片后按顺序拍摄、存储，借助 photoshop软件将图片配准，运用3D-doctor软件进行三维重建，并对图像进行研究分析。
　　结果：
　　①三维组织学重建技术观察睾丸下降：系统性观察：三维组织学重建技术可以将小鼠的泌尿生殖系统主要器官形态重建出来进行系统性观察，通过软件自由旋转可任意角度观察整个系统，通过不同时间点的重建图像研究，可以了解睾丸下降过程中睾丸及相关结构的位置和形态变化，此外，还可通过软件去除某些结构，对被阻挡部分的器官进行详细观察研究；重点结构的观察：将睾丸、附睾、引带三者作为一个研究整体进行重点观察，观察三者的相对位置关系发现：睾丸与附睾头部相连，睾丸下极与附睾尾有引带组织相连，往下延伸包绕附睾尾与输精管返折部分，最终融合而终止于腹股沟内侧壁，但在显微下观察，睾丸与附睾相连部分的引带组织在细胞形态上与附睾尾向下延伸的引带有所不同；附睾尾的位置始终位于睾丸底部之下，附睾下降先于睾丸；在孕期，附睾将睾丸半包绕，出生后，附睾将睾丸的上下极均包绕其中，使睾丸位置相对固定；局部结构的观察：引带（附睾尾向下延伸部分）形态形如锥体状，基底部体积较大，上部较小，出生后引带开始退化，呈现条索状；另外，运用免疫组化 S100显色法可发现引带组织上的支配神经，神经也可标记重建，并在重建出来的图像中观察到神经的大致走向；重建泌尿生殖系统后可自动获得各组织器官的形态学参数，这些形态学参数可进行统计学分析，特别对于不规则的组织、器官，如附睾等，这些形态学参数的获得或许更加弥足珍贵；小鼠双侧睾丸形态大小无明显差异，左侧睾丸先于右侧下降。在 GD15时，双侧睾丸位置仍然很高，位于肾脏下极平面，GD17时，睾丸开始远离肾下极而降至膀胱中部以上，GD19时，睾丸明显远离肾脏，左侧睾丸降至膀胱中部以下，而右侧睾丸位置仍在膀胱中部以上，出生后至PD3时，左侧睾丸下降速度减缓，右侧睾丸下降速度增快，此时双侧睾丸位置基本位于同一水平，PD7时，左侧睾丸下降速度加快，下降程度比右侧大，最终左侧睾丸的位置低于右侧。总的来说，左侧睾丸的下降幅度比右侧大。此外，伴随着睾丸的下降，附睾和引带的形态亦发生了改变。在孕期附睾尾部较短小及粗大，该期附睾并未上下将睾丸包绕，睾丸的上极突出附睾头以上，此时引带的体积相对较大，呈锥体状；出生后附睾尾部变得细小及冗长，此时附睾已将睾丸的上下极完全包绕，使睾丸的位置相对固定，而此期引带亦开始退化为索状组织，形态上较细长。②DES对睾丸下降过程的影响：正常情况下，小鼠双侧睾丸呈现左低右高表现，左侧睾丸比右侧先下降，而且双侧睾丸较圆润，近似球状，经DES处理后，睾丸明显下降受阻，主要表现在左侧睾丸，左侧睾丸均比右侧睾丸位置高，且随DES浓度增加，受影响程度越大；另外，睾丸的形态亦发生了改变，双侧睾丸变得细长，形如梭状，DES剂量在0.5μ g/kg/d和25μ g/kg/d时表现为甚；测量小鼠双侧睾丸体积及表面积参数后进行比较可以得出：正常条件下，左侧睾丸体积及表面积比右侧大，DES作用后其体积和表面积均减小，且随DES浓度增加，减小越明显。正常组与对照组比较，P>0.05,无明显统计学意义，正常组与实验组（I、II、III）比较，P<0.05,差别均有统计学意义。实验组小鼠睾丸体积与表面积均比正常组减小，而且左侧减小的程度比右侧大，随着DES浓度的升高，减小越明显；测量小鼠双侧附睾体积及表面积参数后进行比较可以得出：正常条件下，左侧附睾体积及表面积比右侧大。对于附睾体积，实验组与正常组比较，P<0.05,差别均有统计学意义，实验组双侧附睾的体积均减小，左侧减少程度明显大于右侧，随DES浓度增高，减小的程度亦不同；对于附睾表面积，正常组与实验组比较，实验各组左侧附睾表面积亦明显减少，但右侧未减小，实验组I和实验组III右侧附睾表面积与正常组大致相当，而实验组II右侧附睾表面积却大于正常组。
　　结论：
　　⑴三维组织学重建技术可应用于观察睾丸下降的动态过程，可从系统-重点-局部进行全方位任意角度的观察，并可获得相关形态学参数，特别是对于不规则的器官，从形态上难以辨别其差异性，在获得形态参数后可进行统计分析得出差异性；⑵运用免疫组化S100显色法可标记出引带的神经支配，并可重建出来了解其大致走向；⑶睾丸、附睾、引带三者位置关系紧密，睾丸上极与附睾头连接，睾丸下极与附睾尾连接，向下包绕附睾尾与输精管返折处，最终融合而终止于腹股沟内侧壁，它们的位置和发育变化相互联系，在研究睾丸下降过程时应将其作为一个整体；⑷小鼠双侧睾丸下降在时间上不同步，左侧睾丸比右侧睾丸先下降；在孕期，睾丸从位于肾脏下极开始下降至膀胱，再到膀胱以下而进入阴囊，最终是左侧睾丸位置比右侧底，而且左侧睾丸经历的演变路线比右侧长，提示左侧睾丸的演变过程比右侧更加复杂；⑸EEs对睾丸、附睾、引带等生殖系统组织器官的发育可产生影响，接触浓度越大，影响越明显。此外，EEs对双侧睾丸、附睾的影响不一致，左侧更加容易受影响。三维组织学重建技术可以很好地、系统加局部地显示甚至量化出这种影响。

目录

声明

主要缩略语中英文对照表

第一章 前 言

第二章 实验技术路线

第三章 材料与方法

1.材料

2. 方法

3. 统计分析（statistical analysis）

第四章 结 果

1.正常条件下小鼠泌尿生殖系统的形态

2.DES对小鼠睾丸下降过程的影响

第五章 讨 论

1.三维组织学重建技术

2.胚胎期睾丸的发育

3.睾丸下降与周边毗连相关结构改变的关系

4.三维组织学重建技术研究睾丸的下降过程

5.总结

第六章 结 论

参考文献

综述:环境雌激素对睾丸下降影响的研究进展

发表论文情况

参加学术会议

个 人 简 历

致谢