脑胶质瘤Wip1基因与DNA核苷酸切除修复关系的初步研究

摘要

胶质瘤属于神经上皮组织肿瘤，约占神经系统肿瘤的40％，具有侵袭性强且容易复发等特点。目前治疗以手术为主，辅以化疗和放疗，但预后不佳。由PPM1D基因编码的野生型p53诱导的磷酸酶1（Wild type p53-induced phosphatase1,Wip1）是一种原癌基因。Wip1由p53诱导，且能够通过负反馈调节p53功能在DNA损伤反应中起重要作用。Wip1作为重要的凋亡调节因子，除了在肿瘤的发生中起到重要作用，还参与细胞应激以及DNA损伤修复的调节。此调节过程包括DNA核苷酸切除修复过程。核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)是DNA损伤修复的主要途径，包括 ERCC1—6、XPC、XPA等因子参与其中。XPA是损伤部位的识别蛋白，在NER途径中处于核心地位。XPC在NER过程中起重要作用，可能是激活NER的早期损伤识别因子。XPA和XPC均位于细胞核内，参与到NER过程中。小鼠研究指出，当接受一定强度的紫外线照射时，Wip1可与XPA、XPC发生磷酸化关系导致其失活，进而阻止NER的发生。本研究分为两个部分：
　　第一部分：U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默模型的建立以及协同 TMZ化疗对胶质瘤细胞活性影响的研究。
　　目的：
　　构建U251胶质瘤细胞系Wip1基因沉默模型，研究Wip1基因沉默协同替莫唑胺化疗对胶质瘤细胞增殖情况的影响。
　　方法：
　　体外培养胶质瘤细胞 U251，采用携带 Wip1基因 RNA干扰载体的慢病毒沉默Wip1基因，并经实时定量PCR验证。采用阴性对照病毒感染处理对照组。然后使用替莫唑胺进行化疗干预，将研究分组设定为NC组、NC+TMZ组、Wip1组和Wip1+TMZ组。最后通过CCK-8法检测各组细胞的增殖情况。
　　结果：
　　⑴慢病毒载体包装稳定保存，且含便于荧光显微镜下观察的GTP。本研究以GTP表达率初步判定慢病毒感染效率。每天观察1次。在感染后第3-4天，GTP表达情况可达90%以上（图1-1）。空白对照组、NC组、Wip1组Wip1 mRNA表达情况分析结果分别为1.00±0.00、1.08±0.10、0.30±0.08（表1-1和图1-2）。Wip1组Wip1基因表达明显低于其余两组（P<0.05），差异具有统计学意义。qPCR验证提示经过本课题组慢病毒感染U251胶质瘤细胞，Wip1基因被有效沉默。⑵通过CCK8法检测细胞增殖能力，结果详见图1-3和表1-2。各组细胞增殖速率由低到高依次为Wip1+TMZ组、Wip1组、NC+TMZ组、NC组。随着时间的延长，以上4组差异逐渐增大，第48h（P＜0.05）、72h（P＜0.05）、96h（P＜0.05）、120h（P＜0.05）、144h（P＜0.05）各个时间点组间差异均有统计学意义。化疗干预后第48h、72h、96h、120h以及144h五个时间点，Wip1+TMZ组细胞增殖率低于其他各组（P＜0.05）。在作用48 h后，任两组同一时间测得的OD值差异有统计学意义（P＜0.05）。在后续的实验中，本研究以48 h作为U251胶质瘤细胞分子检测的时间点。
　　结论：
　　①本课题组稳定保存的慢病毒载体能够成功构建U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默模型。②证实无论是单纯的沉默 Wip1基因或替莫唑胺化疗都会抑制U251胶质瘤细胞生长。当两者同时干预，U251胶质瘤细胞生长接近停止。
　　第二部分：U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默以及协同TMZ化疗对DNA核苷酸切除修复酶XPA、XPC的影响。
　　目的：
　　通过靶向Wip1基因沉默协同化疗，探讨U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默以及协同TMZ化疗对DNA核苷酸切除修复酶XPA、XPC的影响。
　　方法：
　　体外培养胶质瘤细胞 U251，采用携带 Wip1基因 RNA干扰载体的慢病毒沉默Wip1基因，并经实时定量PCR验证干扰效率。采用阴性对照病毒感染处理对照组。然后使用替莫唑胺进行化疗干预，将研究分组设定为NC组、NC+TMZ组、Wip1组和Wip1+TMZ组。最后实时定量PCR检测细胞XPA、XPC mRNA表达，免疫印迹检测细胞XPA、XPC蛋白表达。
　　结果：
　　⑴以NC组作为对照组，设定其表达量为1，NC+TMZ组、Wip1（-）组、Wip1（-）+TMZ组的XPA mRNA的相对表达量依次为2.12±0.12、0.62±0.08、1.24±0.24。分别与NC组比较，NC+TMZ组和Wip1（-）组差异显著（P＜0.05），有统计学意义。分别与NC+TMZ组比较，Wip1（-）组和Wip1（-）+TMZ组差异显著（P＜0.05），有统计学意义。NC+TMZ组、Wip1（-）组、Wip1（-）+TMZ组的XPC mRNA的相对表达量依次为1.79±0.14、0.42±0.11、0.87±0.02。分别与NC组比较，NC+TMZ组和Wip1（-）组差异显著（P＜0.05），有统计学意义。分别与NC+TMZ组比较，Wip1（-）组和Wip1（-）+TMZ组差异显著（P＜0.05），有统计学意义。与Wip1（-）组比较，Wip1（-）+TMZ组XPA mRNA的相对表达量增高，差异具有统计学意义。⑵以NC组作为对照组，设定其表达量为1，NC+TMZ组、Wip1（-）组、Wip1（-）+TMZ组的XPA蛋白相对表达量依次为1.44±0.07、0.36±0.04、0.87±0.10；分别与NC组比较，NC+TMZ组和Wip1（-）组差异显著（P＜0.05），有统计学意义。分别与NC+TMZ组比较，Wip1（-）组和Wip1（-）+TMZ组差异显著（P＜0.05），有统计学意义。与 Wip1（-）组比较，Wip1（-）+TMZ组XPA蛋白相对表达量增高，差异具有统计学意义。以NC组作为对照组，设定其表达量为1，NC+TMZ组、Wip1（-）组、Wip1（-）+TMZ组的XPC蛋白相对表达量依次为1.94±0.12、0.37±0.10、0.64±0.04；分别与NC组比较，NC+TMZ组和 Wip1（-）组差异显著（P＜0.05），有统计学意义。与 NC+TMZ组比较， Wip1（-）组XPC蛋白相对表达量增高。
　　结论：
　　①随着Wip1基因被沉默，XPA和XPC的mRNA和核内蛋白表达量随之降低。②替莫唑胺化疗干预能够增加胶质瘤细胞U251中XPA，XPC的mRNA和核内蛋白的表达量。③通过采用shRNA慢病毒感染 U251细胞，成功构建 U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默模型，说明此慢病毒载体稳定且有效。④靶向沉默Wip1基因联合替莫唑胺化疗能够有效抑制胶质瘤细胞生长， Wip1基因有可能导致细胞产生化疗抵抗的重要因素。⑤替莫唑胺化疗干预能够促进并增强U251胶质瘤细胞核苷酸修复过程。⑥U251细胞Wip1基因沉默后，Wip1的下游作用靶点XPA、XPC的mRNA和蛋白表达随之下降。Wip1可能通过作用下游靶蛋白XPA、XPC参与U251细胞核苷酸切除修复过程。

目录

声明

中英文缩略词

背景与目的

参考文献

第一部分 U251 胶质瘤细胞 Wip1 基因沉默模型的建立以及协同TMZ化疗对胶质瘤细胞活性影响的研究

1.1前言

1.2实验材料

1.2.1主要仪器设备

1.2.2主要实验试剂以及实验材料

1.2.3相关实验试剂配制

1.2.4 U251胶质瘤细胞系的复苏、培养、传代以及冻存

1.2.5慢病毒感染U251细胞

1.2.6 荧光实时定量PCR验证U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默

1.2.7 TMZ化疗干预

1.2.8 U251胶质瘤细胞活性检测

1.3实验结果

1.3.1 U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默模型的建立

1.3.2 CCk8法检测U-251细胞增殖能力

1.4讨论

参考文献

第二部分 U251胶质瘤细胞Wip1 基因沉默以及协同TMZ化疗对DNA 核苷酸切除修复酶XPA、XPC 的影响

2.1前言

2.2实验材料

2.2.1主要仪器设备

2.2.2主要实验试剂以及实验材料

2.2.3相关实验试剂配制

2.2.4 U251胶质瘤细胞系的复苏、培养、传代以及冻存

2.2.5 慢病毒感染U251细胞并验证

2.2.6 TMZ化疗干预

2.2.7 荧光实时定量PCR检测U251胶质瘤细胞XPA、XPC的mRNA表达情况

2.2.8 免疫印迹检测U251胶质瘤细胞XPA、XPC的蛋白表达情况

2.2.9 数据分析及统计学处理

2.3 实验结果

2.3.2免疫印迹检测U251胶质瘤细胞XPA、XPC的蛋白表达情况

2.4 讨论

2.4.2替莫唑胺化疗干预促进XPA以及XPC的mRNA 和蛋白表达

参考文献

全文结论

论文发表情况

个人简历

致谢