核苷酸切除修复基因XPB反义RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

摘要

背景与目的:核苷酸切除修复机制是细胞修复损伤DNA的重要途径,肿瘤细胞的耐药常伴随DNA损伤修复基因表达增强,采取反义策略降低细胞的DNA损伤修复能力可以增加肿瘤细胞的药物敏感性。本研究拟构建能在哺乳动物细胞中表达XPB反义RNA的表达质粒pcDNA-XPB/AS(XPB:着色性干皮病B基因),并初步探讨其对肺癌细胞DNA损伤修复能力及抗肿瘤药物耐药性的影响。方法:采用RT-PCR技术扩增的XPBcDNA5'端一段69～520bp的序列被反向插入表达质粒pcDNA3.1/His。将该重组质粒瞬时转染肺癌A549细胞。单细胞凝胶电泳(SCGE)比较阿霉素诱导的转染前后细胞DNA损伤修复情况。MTT法检测转染前后细胞对阿霉素的敏感性。结果:酶切图谱分析和基因测序证实反义表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞XPBmRNA表达水平下降。以4.0μg/ml阿霉素诱导细胞DNA损伤,SCGE显示转染细胞修复DNA损伤能力受到抑制。MTT显示未转染细胞与转染细胞对阿霉素的敏感性存在差别,但无统计学意义。结论:构建的反义表达质粒能下调转染细胞XPBmRNA表达,抑制细胞DNA损伤修复能力,为进一步研究XPB基因功能奠定了基础。