三种微藻对“南澳金贝”体内类胡萝卜素、脂肪酸及相关基因的影响

摘要

华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)是我国南方重要的海水养殖贝类，属热带或亚热带暖水性贝类，主要以海水中的单细胞微藻、有机碎屑等为食饵。华贵栉孔扇贝“南澳金贝”是本课题组经过多年定向选育培育的国家级水产新品种，具有颜值高（贝壳、闭壳肌、外套膜均为金黄色）、营养价值高（富含类胡萝卜素）、经济价值高、抗逆性强等优点。
　　本课题组前期研究发现，“南澳金贝”体内富集的类胡萝卜素不仅与遗传因素有关，而且还与温度、盐度、光照、饵料、年龄、季节等环境生理因素有关。因为扇贝自身不具备合成类胡萝卜素的能力，其体内类胡萝卜素主要源自外界食物。因此，饵料种类对扇贝体内的类胡萝卜素含量有重要影响。此外，作为脂溶性的化合物，类胡萝卜素的吸收可能也与饵料中脂质含量有关。然而，目前在双壳纲贝类中有关饵料、类胡萝卜素和脂质关系间的系统研究较少。
　　本实验以富含类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝“南澳金贝”(6个月龄)及三种不同的海洋微藻（湛江叉鞭金藻、亚心形扁藻、牟氏角毛藻）为研究对象，用三种微藻定量投喂扇贝45天，期间分别在第1、10、25及45天采取闭壳肌、外套膜、鳃、肠道等组织样品。实验结束后，提取并测得总类胡萝卜素含量（Total carotenoids content,TCC）、总脂质含量（Total lipids content,TLC）、脂肪酸含量(Fatty acids content,FAC)；并通过实时定量荧光PCR技术得到相关基因（1、与类胡萝卜素吸收相关的清道夫受体基因-SRB-like-3；2、与脂肪酸合成相关的硬脂酰辅酶A去饱和酶基因-SCD）的转录表达量。最后，通过比较TCC在三组实验贝间的差异，研究饵料对扇贝体内类胡萝卜素的影响；通过分析各组织中的TCC与TLC间的相关性，探究类胡萝卜素的吸收与脂质含量的关系；通过分析各组织中的TCC、TLC、FAC及基因表达量间的相关性，从分子水平上进一步探究饵料对扇贝体内类胡萝卜素、脂质和脂肪酸的影响。主要结果如下：
　　1、不同实验组扇贝体内TCC的比较。三组实验贝体内的TCC均呈现先下降后显著上升的情况(P﹤0.05)。实验过程中投喂金藻的扇贝各组织内TCC始终处于较高水平，硅藻组扇贝中TCC在25天前较低但之后增长迅速，在第45天时其含量与金藻组扇贝无显著差异（P﹥0.05）。
　　2、不同实验组扇贝体内TLC及FAC的比较。在实验前25天，三组扇贝体内TLC变化均不明显，之后其含量均有所增长。实验25天前FAC在三个实验组中的变化均不大且组间不存在显著差异（P﹥0.05），但在实验第45天时三组间FAC出现显著差异：金藻组扇贝中FAC与单不饱和脂肪酸含量（MUFAC）显著高于扁藻组扇贝（P﹤0.05）。
　　3、克隆获得了华贵栉孔扇贝“南澳金贝”的SCD基因cDNA序列。首先从本课题组华贵栉孔扇贝转录组数据库中得到该基因的部分cDNA中间片段，然后利用RACE（cDNA末端快速扩增）技术克隆得到SCD基因的全长。SCD基因全长有2421bp,包括一个990bp的开放阅读框，编码329个氨基酸残基。经过多序列BLAST对比鉴定，该基因属于FAD家族。
　　4、基因表达及其与TCC、TLC、FAC间的关系。采用实时荧光定量PCR测定了45天时扇贝组织样品中SCD与SRB-like-3基因的表达量，发现SCD基因在投喂金藻的扇贝肠道中表达最高；SRB-like-3基因在投喂金藻的扇贝闭壳肌和肠道中表达量最高。相关性分析结果显示，扇贝组织中TCC与微藻中TLC及与扇贝组织中的TLC、FAC均存在显著性正相关（P<0.05）；SCD基因表达量与扇贝闭壳肌组织中的FAC及饱和脂肪酸含量（SFAC）有显著性正相关（P<0.05）；但与多不饱和脂肪酸含量（PUFAC）无显著相关性（P﹥0.05）。SCD基因与SRB-like-3基因表达量在肠道中有极显著的正相关（P<0.01）。因此，可初步推测饵料中的脂质有利于扇贝对类胡萝卜素的吸收，SCD基因和SRB-like-3基因可能共同参与了扇贝对类胡萝卜素的吸收。
　　本研究系统分析了饵料对扇贝体内类胡萝卜素及脂质、脂肪酸含量的影响，初步探究了扇贝体内脂质及脂肪酸与类胡萝卜素含量的关系；首次探讨了SCD基因和SRB-like-3基因在海产贝类类胡萝卜素吸收中的作用。研究结果丰富了贝类营养学理论，也可为营养价值高的贝类新品种培育提供科学指导。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 微藻在水产养殖动物中的应用

1.2 类胡萝卜素的概述

1.3 脂肪酸去饱和酶的研究进展

1.4 SR-BI 基因的研究进展

1.5 华贵栉孔扇贝“南澳金贝”的研究背景

1.6 研究的目的及意义

第二章 三种微藻对扇贝体内总类胡萝卜素及脂质含量的影响

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4总类胡萝卜素与总脂质及脂肪酸含量的相关性分析

2.5讨论

第三章 基因克隆及表达

3.1 实验材料

3.2 实验仪器与试剂

3.3 SCD基因的克隆

3.4 基因在组织中的定量表达

3.5 实验结果

3.6 SCD与SRB-like-3基因在扇贝组织中的表达

3.7 相关性分析

3.8 讨论

总结、创新与展望

论文总结

论文创新点

论文展望

参考文献

致谢

学术交流及论文撰写情况