大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌抑菌机制的研究

摘要

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和乙型链球菌（beta hemolytic streptococcus）是水产动物的常见致病菌，对人类健康和水产经济带来巨大威胁。由于抗生素的滥用，药物残留和耐药性变得日益严重。人们迫切需要寻找不易产生耐药性的，低毒的新型抗菌物质。本研究以70％乙醇提取的大黄（Rhubarb）为抑菌材料，从抑菌圈、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）方面探讨了大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌生长的影响。通过电子扫描显微镜、测定菌液中蛋白浓度变化、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质质谱鉴定（MS）、双向凝胶电泳（2-DE）等方法研究了大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌的抑制机制。
　　1、抑菌结果显示，大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌的抑制效果明显，其抑菌圈大小分别为24.5±0.2mm和23.0±0.2mm。大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌的MIC和MBC都是3.91mg/mL。
　　2、应用了扫描电镜观察大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌的细胞壁、细胞膜的作用。结果发现，经1/2MIC大黄醇提物处理后，嗜水气单胞菌菌体表面变粗糙，出现裂解并且菌液的蛋白含量明显升高；乙型链球菌菌体表面虽然皱褶，但是形态依然完整，菌液中的蛋白含量也没有明显变化。说明大黄醇提物对嗜水气单胞菌的细胞壁和细胞膜有一定的破坏作用，而对乙型链球菌的细胞壁和细胞膜影响很小。
　　3、通过SDS-PAGE和可溶性蛋白含量测定分析大黄醇提物对细菌蛋白表达的作用，结果表明：1）经大黄醇提物处理后，嗜水气单胞菌的蛋白表达量在4 h时产生明显变化（P<0.05），再经2-DE电泳进行特异性蛋白的分离，并用质谱鉴定，发现了三个差异性蛋白：分别为转录延长因子GreA（transcription elongation factor GreA），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase），烷基氢过氧化物还原酶亚基C（alkyl hydroperoxide reductase subunit C），这3个蛋白对细菌的正常生理及其结构极为重要。2）经大黄醇提物处理后，乙型链球菌蛋白表达量受到的影响不明显，但SDS-PAGE图谱上，发现了多条缺失条带。通过2-DE电泳进行特异性蛋白的分离，并用质谱鉴定了这些差异性蛋白分别为磷酸丙酮酸水合酶（phosphopyruvate hydratase）、丙酮酸脱氢酶E1（pyruvate dehydrogenase(acetyl-transferring)E1）、磷酸甘油变位酶（phosphoglyceromutase）、磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase[Bacilli]）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（type Iglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[Bacilli]）、转酮醇酶（transketolase）、氨基甲酸激酶1（carbamate kinase1）、蛋白核糖体蛋白S2（30S ribosomal protein S2[Bacilli]）、60kD伴侣蛋白（60kD chaperonin）和假定蛋白（hypothetical protein）。通过查阅文献可知，前7种酶是微生物糖酵解、氨基酸代谢及戊糖磷酸途径中必须的；蛋白核糖体蛋白S2和60KD伴侣蛋白主要与蛋白合成和折叠有关；而假定蛋白具体功能未知。
　　综上所述，大黄醇提物能有效抑制嗜水气单胞菌和乙型链球菌的生长。但作用方式不同，大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑制机制是破坏细胞膜的完整性和影响某些蛋白的表达导致菌体裂解死亡；大黄醇提物对乙型链球菌的抑菌机制是影响糖酵解、尿素循环、戊糖磷酸途径和特异性蛋白表达，从而导致细菌的死亡。

目录

声明

缩略语

第一章 前言

1 嗜水气单胞菌和乙型链球菌的研究概况

1.1嗜水气单胞菌研究概况

1.2乙型链球菌研究概况

2 中药抑菌机制的研究概况

2.1中药对细胞壁和细胞膜的影响

2.2中药对蛋白质和遗传物质的影响

2.3中药对呼吸代谢的影响

3大黄的研究进展

3.1大黄的主要成分

3.2 大黄的药理作用

4本研究的意义及目的

第二章 大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌的抑制作用

1 实验材料

1.1 材料及试剂

1.2 实验仪器

2 实验方法

2.1 菌种活化

2.2 菌液浓度测定

2.3 大黄醇提物

2.4 大黄醇提物的成分分析

2.5抑菌圈测定

2.6 最小抑菌浓度测定

2.7 最小杀菌浓度测定

3 结果

3.1 大黄醇提物高效液相色谱图分析

3.2 大黄醇提物和单体对实验菌抑菌圈的大小

3.3 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

4 讨论

第三章 大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌的抑制机制

1 实验材料

1.1 材料与试剂

1.2 溶液配制

1.3 实验仪器

2 实验方法

2.1 扫描电镜观察

2.2 蛋白浓度标准曲线绘制

2.3 细菌可溶性蛋白含量的测定

2.4 电泳法分析

2.5 蛋白质双向电泳

2.6 质谱分析的样品处理

2.7 蛋白质质谱操作

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 扫描电镜

3.2 大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌细胞膜的作用

3.3 大黄醇提物对嗜水气单胞菌和乙型链球菌蛋白表达的影响

3.4 嗜水气单胞菌和乙型链球菌的双向电泳

3.5 质谱鉴定

4 讨论

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

硕士期间论文发表情况

致谢