NOD2/CARD15基因突变与中国人克罗恩病相关性研究

摘要

背景、目的： 克罗恩病(Crohn’s disease，CD)是炎症性肠病(IBD)的一个主要类型，是一种累及全层节段性肠道的非特异性炎症。CD在亚洲的发病率远低于西方国家，近年来该病的发生有上升趋势，在中国CD的发病率也有上升趋势。CD的病因及发病机制并不明确，临床表现也复杂多样，且容易误诊，复发率高。 近年来的观点认为，携带遗传易感基因的宿主在环境因素参与下，免疫功能紊乱，最终导致疾病发生。研究发现NOD2/CARD15基因序列单核苷酸多态性(single nucleotide Polymorphisms，SNP)与CD明显相关，发现并证实其上有3个SNP(R702W，G908R，3020 insC)与欧美白种人CD显著相关，并且认为NOD2/CARD15基因突变与发病年龄、病变部位及临床特征有关。上述现象在德国、澳大利亚及英国等人群中均得到验证，但在日本、我国香港和浙江地区的小样本研究并未发现上述3个SNP的改变。本课题组前期对30例CD患者NOD2基因第4、8及11对外显子测序分析也没有发现上述3个SNPs，提示在白种人中与CD易感相关的3个SNPs可能与东方人无关，但却发现NOD2/CARD15基因另外一个突变点P268S可能与中国人CD相关，30例CD病人中有4例存在着P268S改变，其发生率为13.3％。 NOD2蛋白能对细菌成分产生反应，激活核转录因子к B(Nucleartranscriptional factor к B，NF-кB)。NOD2蛋白结构为N端2个串联重复序列(CARD-CARD区)，中间1个核苷酸结合区域(NBD区)和C端富含亮氨酸的重复区域(LRR)。在NOD2激活NF-кB的过程中，2个CARD充当效应器作用，NOD2通过其与丝氨酸-苏氨酸激酶(serine-threonine kinase，RICK)之间CARD-CARD的嗜同种相互作用激活NF-кB。LRRs区域又称模式识别受体，它具有识别多种分子如蛋白、肽、碳氢化合物等功能的重复序列，可识别微生物产物的不同分子结构模式包括细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，L PS)，从而使NOD2寡聚化并与RICK相互作用，进而激活NF-кB.当NOD2/CARD15基因突变导致其氨基酸序列和长度发生改变时，蛋白功能发生改变，不能有效激活NF-кB，导致机体先天性免疫系统低反应性，从而诱导机体对肠道细菌异常强烈的免疫反应而引起CD发生。本研究的目的在既往研究的基础上进一步扩大样本量对NOD2/CARD15基因12对外显子进行了系统的筛查，发现与中国人CD发病相关SNP以及该SNP与CDI临床特征的相关性，为进一步研究CD发病机制奠定基础，为防治该病提供理论依据。 方法： 1、收集南方医院消化科及普外科确诊临床资料完整、彼此无血源关系的广东及外省籍CD患者48例(包括前期收集病例30例和新收病例18例)，溃疡性结肠炎(UC)患者及门诊健康体检者各50例，抽取外周血，提取白细胞基因组DNA，根据NOD2/CARDl5基因12个外显子设计15对引物，PCR扩增目的片段。 2、成功扩增48例CD患者NOD2/CARDl5基因12个外显子后，将PCR产物纯化，然后通过ABI377和ABI3730测序仪采用双脱氧四色荧光法全自动测读序列，并与基因库数据对照，发现突变位点后，对该序列进行反向测序，明确该突变位点确实存在，并用同样的一对引物扩增50例溃疡性结肠炎患者和50例健康体检者NOD2/CARD15基因相应目的片断，纯化PCR产物，用同样的方法测序并与基因库数据对照。 3、根据P268S突变位点设计酶切引物及选择相应的内切酶，PCR扩增目的片段，成功扩增后，用BamHI酶切鉴定已发现的P268S突变位点。并发现其在UC组及健康体检者组中的发生频率。 结果： 1、NOD2/C/IRD15基因中与中国人CD相关的突变位点： 通过DNA测序及PCR-RFLP酶切验证，有5例CD患者发现有P268S突变，其中3例为杂合子改变，2例为纯合子改变，其中4例为前期工作中已经发现的，1例为新收病例中发现的，发生率为10.4％，其碱基由C变成T，密码子由CCC变成UCC，编码的氨基酸由脯氨酸变成丝氨酸，而UC组和HC组没有发现1例P268S突变，各组间差异有统计学意义(Fisher精确概率检验P=0.003)，在对NOD2/CARD15基因12个外显子其他片段的测序中没有发现新的突变位点。提示P268S可能是NOD2/CARD15基因与中国人相关的突变位点。所有病例没有发现1例有R702W，G908R及3020 insC三个常见于西方人的基因多态位点。 2、P268S改变与CDI临床特征的相关性： 48例CD患者中，12例发病年龄小于20岁的患者中有4例发现P268S突变，36例发病年龄大于20岁的患者中只有1例发现P268S突变，两组比较差异有统计学意义(Fisher精确概率检验P=0.011)，说明P268S突变与CD患者的发病年龄明显相关。36例男性患者中发现3例P268S突变，12例女性患者中发现2例P268S突变，两组比较差异无统计学意义(Fisher精确概率检验P=0.587)，说明P268S与CD患者的性别无相关性。5例有P268S突变者病变部位均在回肠，而病变位于结肠及其他者未见P268S突变，各组间比较差异有统计学意义(Fisher精确概率检验P=0.001)，说明P268S突变与CD患者的发病部位有明显相关性，有P268S突变的CD患者病变部位主要在回肠。5例有P268S突变的患者全部并发有肠腔狭窄，而32例无并发肠腔狭窄的患者中均未见P268S突变，两组间比较差异有统计学意义(Fisher精确概率检验P=0.003)，说明P268S突变与CD患者的并发症有明显相关性，有P268S突变的CD患者较易并发肠腔狭窄、肠梗阻。26例中度病变的患者中发现4例P268S突变，11例重度病变的患者中发现1例P268S突变，两组间比较差异无统计学意义(Fisher精确概率检验P=0.289)，说明P268S突变与CD患者的病变程度无明显相关性。 结论： 1、研究发现P268S可能是NOD2/CARDl5基因与中国人CD发病相关的SNP，而与UC无关，除P268S外没有发现其它的突变位点。 2、在研究中没有发现R702W，G908R及3020sinC三个常见于西方人CD的基因多态位点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略语词表

声明

前言

第一章PCR直接测序法检测克罗恩病患者NOD2/CARD15基因外显子

引言

材料与方法

结果

结果分析

第二章PCR-RFLP验证P268S突变位点

引言

材料与方法

结果

酶切结果分析

全文结果总结

讨论

全文小结

参考文献

在读期间发表论文情况

致谢