脉冲磁场和补阳还五汤对脑缺血再灌注大鼠IGF-1表达影响的研究

摘要

研究背景： 近年来，对磁场的生物学效应及治疗作用进行了深入的研究，磁场对脑损伤性疾病的影响研究已成为一个热点。动物实验和临床研究均证实磁刺激对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，有助于改善急性脑梗死患者神经功能缺损。本课题设计利用磁场干预大鼠脑缺血再灌注模型，探讨磁场对脑缺血大鼠脑内IGF-1表达的影响以及对神经功能缺失、脑缺血梗死面积、缺血后病理组织学的影响，为磁场的神经保护作用提供实验室基础。 补阳还五汤(BYHWD)始载于《医林改错》，由清代名医王清任所创，以补气药与活血祛瘀药相配伍，以益气固摄为主，化瘀通络为辅，具有补气活血，通经活络的功效，是治疗气虚血瘀型脑缺血疾病的名方。本文利用BYHWD灌注脑缺血再灌注大鼠，观察BYHWD对IGF-1表达的影响以及BYHWD对神经功能缺失、脑缺血梗死面积、缺血后病理组织学的影响，以期发现BYHWD与IGF-1在神经修复方面有无内在关系，为BYHWD的神经保护作用提供新的实验室基础。 目的：观察脑缺血再灌注后时间与IGF-1表达的关系，研究磁场、BYHWD对脑缺血再灌注大鼠IGF-1表达的影响，为磁场、BYHWD的脑保护作用提供实验室依据。 设计：完全随机设计。 方法： 1.40只SpragueDawley(SD)大鼠分为假手术组、缺血再灌注后2h组、1d组、3d组和7d组，每组8只。2h组、1d组、3d组、7d组用线栓法阻断右侧大脑中动脉供血，2h后拨出线栓恢复大脑中动脉供血制成右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，假手术组仅做右侧颈外动脉和颈总动脉结扎，不做右侧大脑中动脉线栓栓塞。参照ZealLonga5分法进行评分。0分：无神经功能缺损症状；1分：轻度局灶性神经功能缺损，即提尾悬空不能伸展左侧前爪；2分：中度局灶性神经功能缺损，即行走向左侧转圈；3分：中度局灶性神经功能缺损，即行走困难，并向左侧倾倒；4分：不能自发行走，意识水平下降。评分1～4分为造模成功。32只大鼠造模成功。各组动物分别在造模后0h(假手术组)、2h、1d、3d、7d处死，断头取脑。主要观察指标：用免疫组化法(IHC)观察各组梗死区IGF-1的表达。 2.80只SD大鼠分为假手术组、模型组、脉冲磁场组、BYHWD组、脉冲磁场联合BYHWD组(联合组)，每组16只，模型组、脉冲磁场组、BYHWD组和联合组制作右侧MCAO模型，假手术组仅做右侧颈外动脉和颈总动脉结扎，不做右侧大脑中动脉线栓栓塞。脉冲磁场组和联合组于造模结束后开始用脉冲磁疗仪进行干预，异名磁极对置于大鼠头部，磁距为7～10cm，磁场强度为0～0.01T，频率为50HZ，20min／次，每天1次，连续7d；BYHWD组和联合组予灌服BYHWD水煎液，按生药13.3g／kg灌胃，连续给药7d；假手术组和模型组不作磁场处理及BYHWD灌胃处理。7d后处死各组大鼠，断头取脑。主要观察指标：①分别在2h、1d、3d、7d进行神经功能缺失评分；②采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察梗死面积大小；③苏木素-伊红染色(HE)观察病理组织学改变；④IHC检测IGF-1的表达。 结果：120只大鼠进入结果分析。 1.脑缺血再灌注大鼠IGF-1的表达 采用单因素方差分析的检验方法，组间多重比较采用LSD检验，组间比较有统计学差异(F=60.867，P=0.000)。经组间多重比较显示：IGF-1在假手术组神经细胞中表达最弱，与假手术组相比，缺血再灌注后2h组、1d组、3d组、7d组梗死区阳性细胞数增多，差异有统计学意义(P=0.000)；与2h组、1d组相比，3d组阳性细胞数增多，其差异有统计学意义(P=0.000)；与3d组相比，7d组阳性细胞数有所下降，差异有统计学意义(P=0.000)；与1d组相比，7d组阳性细胞数无显著性差异(P=0.712)，但与假手术组相比，差异有统计学意义(P=0.000)。 2.脉冲磁场、BYHWD对脑缺血再灌注大鼠IGF-1表达的影响 2.12h、1d、3d、7d神经功能缺失评分 采用重复测量的检验方法，时间因素不同水平组间多重比较及固定时间因素后不同实验分组间的多重比较均采用LSD方法。 假手术组在2h、1d、3d、7d时神经功能缺失评分均为0分。模型组、脉冲磁场组、BYHWD组和联合组各组间比较存在统计学差异(F=5.479，P=0.032)，神经功能缺失评分在不同的时间之间有显著差异(F=106.922，P=0.000)，组别与时间有交互效应(F=3.867，P=0.000)。从3d开始，各组神经功能缺失评分随时间的延长呈逐渐下降趋势：从时间点来看，2h和1d时模型组、脉冲磁场组、BYHWD组和联合组的评分无显著差异(F=0.760，P=0.521和F=1.538，P=0.214)；3d时模型组、脉冲磁场组、BYHWD组和联合组的评分有显著差异(F=12.612，P=0.000)，BYHWD组、脉冲磁场组和联合组的评分低于模型组，联合组的评分低于BYHWD组、脉冲磁场组；7d时模型组、脉冲磁场组、BYHWD组和联合组的评分有显著差异(F=4.609，P=0.002)，脉冲磁场组、BYHWD组和联合组评分均低于模型组，脉冲磁场组、BYHWD组和联合组评分无显著性差异 2.2脑组织TTC染色结果 脑梗死面积百分数的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD检验。假手术组脑组织切片均红染，无白色梗死灶。模型组大鼠梗死灶位于缺血侧脑组织额顶部外侧皮层，脑梗死灶明显，梗死区内坏死组织呈苍白色，未坏死组织呈玫瑰红色。各组间比较差异有统计学意义(F=30.383，P=0.000)。经组间多重比较显示：与模型组相比，脉冲磁场组、BYHWD组、联合组梗死面积均减小，差异有统计学意义(P=0.000)。与脉冲磁场组相比，BYHWD组梗死面积差异没有显著性意义(P=0.552)。联合组与脉冲磁场组和BYHWD组相比，梗死面积减小，其差异有统计学意义(P=0.009，P=0.035)。 2.3脑组织切片HE染色结果 假手术组：神经细胞数目多，形态结构清楚，细胞排列规整。核深染，核膜清晰，核仁明显。高倍镜下可见神经元细胞胞浆丰富，呈灰蓝色斑块状，表明尼氏体丰富。 模型组：坏死区结构紊乱，组织染色变浅，组织结构疏松，胶质细胞增生，部分神经元细胞核固缩，胞体缩小变形，残留的神经元细胞周围间隙增宽，神经元细胞正常形态消失，胞质红染、均匀，可见鬼影细胞。边缘区低倍镜下可见较多形态大致正常的神经元细胞，胶质细胞无明显增生，组织颜色较深。在高倍镜下可见边缘区部分神经元细胞浆染色呈淡染，尼氏小体消失，并可见神经元细胞核固缩。 脉冲磁场组：坏死区胶质细胞较模型组增生明显，形成胶质结节，出现噬神经现象，仍可见较完整的红色神经元细胞，个别神经元细胞核固缩，胞体缩小变形。边缘区在高倍镜下可见边缘区神经元细胞胞浆蓝染，呈颗粒状，尼氏体丰富。神经元形态较规整，核深染，核仁清。 BYHWD组：坏死区胶质细胞较模型组增生明显，有胶质结节形成，可见较完整的红色神经元细胞，个别神经元细胞核固缩，胞体缩小变形。高倍镜下可见边缘区神经元细胞胞浆蓝染，颗粒状，尼氏体较丰富，神经元形态较规整，核深染，核仁清。 联合组：坏死区胶质细胞较模型组增生明显，可见完整的红色神经元细胞。高倍镜下可见边缘区神经元细胞形态规整，核深染，核仁清，神经元细胞胞浆蓝染明显，呈颗粒状，尼氏体丰富。 2.4脉冲磁场和BYHWD干预后IGF-1的表达结果 脉冲磁场与BYHWD干预后IGF-1阳性细胞数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD检验。各组间比较，差异有统计学意义(F=592.714，P=0.000)。经组间多重比较显示，IGF-1阳性细胞数在假手术组最少；与假手术组相比，模型组缺血再灌注7d后缺血梗死侧大脑皮层IGF-1阳性细胞数增多，差异有显著性意义(P=0.007)；与假手术组和模型组相比，BYHWD组缺血再灌注7d后IGF-1阳性细胞数增多，差异有显著性意义(P=0.000)；与假手术组、模型组和BYHWD组相比，脉冲磁场组阳性细胞数增多，差异有统计学意义；与假手术组、模型组、脉冲磁场组和BYHWD组相比，联合组再灌注7d后IGF-1阳性细胞数增多，差异有显著性意义(P=0.000)。 结论：正常情况下脑组织中仅有少量IGF-1表达，脑缺血再灌注发生后，脑中IGF-1的自分泌即启动，再灌注3d后IGF-1的表达达到高峰，7d缺血侧大脑皮层IGF-1的表达有所下降，但仍明显高于假手术组。这表明脑缺血再灌注可促进内源性IGF-1的分泌，有助于缺血状态下神经组织的自我保护和修复，但这种促分泌作用维持时间不长。脉冲磁场和BYHWD干预后缺血再灌注大鼠神经功能评分改善明显、脑梗死面积减小，神经系统的保护和修复作用明显增强，且脉冲磁场、BYHWD可以促进IGF-1的表达，增强脑损伤后的内源性保护机制，二者联合使用在促进神经功能恢复、减小脑梗死面积，及促进IGF-1表达方面作用更强，说明脉冲磁场和BYHWD有协同作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 文献回顾

第一节IGF-1与脑缺血研究现状

第二节磁场对脑缺血的保护作用的研究现状

第三节补阳还五汤对脑缺血保护作用的研究现状

第二章 实验部分

第一节脑缺血再灌注大鼠IGF-1的表达

第二节脉冲磁场和BYHWD对脑缺血再灌注大鼠IGF-1表达的影响

第三节讨论

第三章 全文总结

参考文献

附图

攻读学位期间的成果

致谢

统计证明