曲古抑菌素A对T细胞的影响及在大鼠肾脏移植中的应用

摘要

研究目的： 随着器官移植技术的发展，我国接受器官移植的患者逐年增多，这些患者术后需长期服用各类免疫抑制剂进行抗排斥治疗，尽管这些药物的作用机理和作用环节不尽相同，但都不可避免的具有毒副作用，而且某些免疫抑制剂的治疗窗较窄，药代动力学方面也存在明显的个体差异，需要密切监测药物浓度，给术后长期治疗增加负担。因此开发新型的针对性强、副作用小的免疫抑制剂就显得尤为必要。 组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够调控组蛋白乙酰化／去乙酰化平衡从而在基因表达调控、DNA复制及修复等过程中起着重要的作用，它参与多种基因的转录调控。我们研究的目的在于探讨曲古抑菌素A这种组蛋白去乙酰化酶抑制剂影响T细胞免疫功能的作用机制，包括对T细胞的活化和增殖这个器官移植的免疫过程的中心环节的影响、对免疫应答过程中具有重要意义的IL-2表达的影响，以及对异体大鼠肾脏移植模型中移植肾的影响，为其应用于器官移植领域的免疫治疗及诱导免疫耐受提供理论及实验依据。 实验方法： 1.不同浓度TSA对小鼠外周血、脾脏T细胞数量检测： 将40只昆明种小鼠随机分为5组，各8只。A组(空白对照组)：生理盐水0.5ml／kg/d皮下注射；B组(CTX组)：CTX20mg/kg/d皮下注射；C组(TSA1组)：TSA0.4mg／kk/d皮下注射：D组(TSA2组)：TSA0.8mg／kg/d皮下注射；E组(TSA3组)：TSA1.6mg/kg/d皮下注射；处理一周后分别取小鼠外周血及脾脏，其中脾脏制成脾细胞悬液。分离外周血及脾脏淋巴细胞，用α-醋酸萘酯酶染色法观察实验小鼠T细胞的数量变化情况。 2.TSA对小鼠外周血、脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量及比值检测： 同样取上述方法处理过的外周血和脾脏，分离外周血及脾细胞悬液中淋巴细胞，加入Ratanti-mouseLyt2+及Ratanti-mouseL3T4+荧光标记小鼠单克隆抗体，流式细胞仪检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量并计算其比值。 3.观察TSA对MLC中淋巴细胞增殖作用的影响 分别取BALB／c及C57BL小鼠脾脏制成单细胞悬液，以淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调细胞数为1×106个／ml。两种淋巴细胞1:1混合后加入96孔板，每孔加入上述细胞悬液100μL及0.16、0.8、4、20、100、500nmol／L不同稀释度的TSA100μL，对照组用等体积RPMI-1640培养液代替，分别在作用12h、24h及48h后每孔加入0.5％MTT20μL作用4小时，经1500rpm离心10min，弃上清液，再加入100μLDMSO溶液，用酶标仪于570nm波长下测OD值。每浓度设5个复孔，以未加TSA组细胞作为对照。根据OD值算出各组细胞抑制率的大小。 4.TSA对激活淋巴细胞IL-2表达的影响 制备C57BL小鼠脾脏淋巴细胞悬液，并调整细胞数为1×106个／ml作为反应细胞；分离BALB／c小鼠淋巴细胞，加入丝裂霉素75nmol／L，孵育30min后去除残余丝裂霉素，调整细胞数为1×106个／ml作为刺激细胞。实验组取反应细胞及刺激细胞各1ml，置于细胞培养板内，每组设6个复孔，分别加入1μmol莫能霉素，放入37℃，5％的CO2孵箱培养，48h后按50μL／孔分别加入0.16、0.8、4、20、100、500nmol／L浓度TSA；阳性对照组用CTX代替TSA：阴性对照组使用RPMI-1640培养液代替TSA。第4天取细胞，用IL-2荧光标记单抗染色后流式细胞仪分别检测各组荧光值。 5.大鼠原位肾脏移植模型的建立 供体手术：取成年雄性Wistar大鼠，戊巴比妥腹腔麻醉后，取腹部正中T型切口，充分暴露左肾、腹主动脉和下腔静脉。游离左肾并完全游离左肾动静脉，分别结扎、切断左肾动静脉主干各分支，在左肾动静脉上方阻断腹主动脉和下腔静脉，于左肾动脉下方穿刺腹主动脉并固定穿刺导管，剪开肾静脉下段下腔静脉，用4℃的HCA液经穿刺导管灌注，至肾脏变灰白，下腔静脉流出的灌注液清亮为止。游离输尿管至膀胱，带腹主动脉及下腔静脉瓣剪断肾动静脉，带膀胱瓣取下肾脏。置于冰水中进一步去除肾动、静脉断端残余的脂肪及多余的外膜，从根部切断肾动静脉，修剪膀胱，保留输尿管开口周围膀胱瓣，供肾置于冰袋中保存备用。 受体肾移植手术：SD大鼠同样取上述切口，充分游离左肾动、静脉，在靠近腹主动脉及下腔静脉根部夹闭左肾动、静脉，在靠近根部约1／3处切断左肾动静脉，沿左肾下极切断并结扎左侧输尿管，摘除左肾。以11-0和9-0无创缝合线间断端端吻合供受者肾动静脉，开放血流后将膀胱瓣与受者膀胱做间断缝合。 6.观察移植肾的组织病理形态变化： 成功构建9只异体大鼠原位肾脏移植模型，随机分为3组，实验组采用TSA1mg／kg/d皮下注射；CTX对照组：CTX20mg／kg/d皮下注射；空白对照组采用生理盐水10ml／kg/d皮下注射；连续3天后处死大鼠，取移植肾，10％福尔马林固定后，切片并进行HE染色，镜下观察移植肾病理形态变化。 三结果： 1.TSA减少小鼠外周血中T细胞的数量并同时减少CD4+、CD8+亚群数量及比值，对CD4+亚群的作用强于CD8+亚群： 分别予TSA0.4、0.8、1.6mg/kg/day作用后，外周血T淋巴细胞数量逐渐下降，与对照组比较，均有显著性差异；对CD4+T细胞数量及百分比而言，各浓度组及对照组之间均有显著性差异，而对CD8+T细胞数量而言，浓度达到0.8mg时才具有显著性差异；对于CD4+／CD8+比值TSA浓度达到0.8mg/kg/day时CD4+／CD8+比值与对照组比较才具有统计学差异。 2.TSA减少小鼠脾脏中T细胞数量，也同时减少CD4+、CD8+亚群数量及比值，这种作用比对外周血T细胞作用弱： TSA处理后的小鼠脾脏中T淋巴细胞同样有所减少，与对照组相比，TSA浓度达到0.8mg/kg/day时才具有统计学差异；同对外周血作用相似，TSA可以减少CD4+、CD8+T细胞数量、百分比以及CD4+／CD8+比值，但与对照组比较时，均显示出浓度达到0.8mg/kg/day时与对照组比较才具有显著性差异。这种作用较对外周血T细胞而言显然要弱。 3.TSA抑制混合淋巴细胞培养中淋巴细胞的增殖作用 TSA与混合淋巴细胞培养体系共同作用后，明显抑制淋巴细胞的增殖反应，且随着TSA浓度和作用时间的逐步增加，其抑制作用逐步增强，其中TSA浓度为500nmol／L作用48小时后对淋巴细胞增殖的抑制率达到59.9％，表现出较强的抑制作用；与对照组两两比较，作用12h时，0.16nmol／L组与对照组比较无显著性差异，其余各浓度组在不同的作用时间段与对照组比较均有显著性差异。 4、TSA抑制单向混合淋巴反应中激活淋巴细胞IL-2的表达 TSA可以显著抑制经刺激激活的小鼠淋巴细胞的IL-2的表达，并且随着TSA浓度的逐步升高，IL-2表达逐步下降；与对照组两两比较，TSA浓度达到0.8nmol/L时与对照组比较有显著性差异。 5、成功构建大鼠肾脏移植模型 成功构建大鼠肾脏移植模型9例，1例死于吻合口出血，1例术后第一天因血栓死亡，1例尿漏；手术时间平均约150min，其中供体摘取手术时间约45min，受体手术时间约为100min;热缺血时间约30s，冷缺血时间平均90min：9例成功的受体SD大鼠存活时间均达到3d： 6、TSA明显抑制大鼠肾移植模型中移植肾淋巴细胞浸润、间质水肿等急性排斥反应征象 空白对照组：移植肾镜下表现为严重的急性排斥反应特征，间质明显水肿并淋巴细胞的弥漫性浸润，肾小球毛细血管丛充血，淋巴细胞浸润致肾小球体积增大，肾小球旁淋巴细胞广泛浸润球囊壁层，淋巴细胞浸润肾小管导致部分肾小管坏死变性。 TSA组与急排组镜下差别不明显，但较其病理改变轻，仍然可见肾小动脉周围广泛淋巴细胞浸润，肾小管间质和肾小球旁淋巴细胞灶性浸润。 CTX组肾小球血管轻度扩张，阃质水肿不明显，淋巴细胞浸润明显减少，肾小管间质仍有少量细胞浸润，肾小管结构完整，表明肾移植的急性排斥反应受到了明显的抑制。 四结论： 1.TSA明显减少小鼠外周血及脾脏中T淋巴细胞数量，且与浓度相关，对脾脏的作用弱于对外周血作用； 2.TSA减少小鼠外周血及脾脏中T细胞亚群CD4+和CD8+T细胞数量，对CD4+亚群的抑制作用强于对CD8+亚群同时也减少CD4+／CD8+比例； 3.TSA抑制混合淋巴细胞培养中淋巴细胞的增殖，并且具有明显的量效及时效依赖性； 4.TSA减少单向混合淋巴细胞培养中激活T淋巴细胞表达细胞因子IL-2； 5.TSA减弱了大鼠肾脏移植模型的细胞性排斥反应，抑制机体对移植物的免疫应答。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第1章TSA对小鼠T细胞数量及亚群的影响

第1节实验材料与仪器设备

一．动物模型及实验分组

二．药品试剂及仪器

第2节实验方法

一．实验步骤及内容

二．统计学方法

第3节实验结果

第4节讨论

参考文献

第2章TSA对小鼠混合淋巴细胞培养中淋巴细胞增殖和IL-2表达的影响

第1节实验材料与仪器设备

一．实验动物

二．药品试剂及仪器设备

第2节实验方法

一．实验步骤及内容

二．统计学方法

第3节实验结果

第4节讨论

参考文献

第3章原位大鼠肾脏移植模型的构建

第1节实验材料与仪器设备

一．实验动物及分组

二．药品试剂及主要仪器

第2节实验方法

一．供体肾脏摘取及修肾术

二．受体肾移植手术

第3节实验结果

第4节讨论

参考文献

第4章TSA对大鼠移植肾组织病理形态的影响

第1节实验材料与仪器设备

一．实验动物及分组

二．药品试剂及主要仪器

第2节实验方法及步骤

一． 取材、固定及切片的制作

二．切片的HE染色过程

三．组织形态学观察

第3节实验结果

第4节讨论

参考文献

全文小结

综述 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在器官移植中的研究进展

在读期间发表或待发表的论文

研究生毕业论文统计学审稿证明

致谢