冷缺血损伤对大鼠供肾致纤维化细胞因子的影响

摘要

研究背景和目的 肾脏移植是治疗终末期肾病的最佳治疗手段。虽然随着移植手术技巧的改进，新型免疫抑制药物的应用，围手术期并发症及早期急性排斥反应发生率明显减低，大大增加了移植物一年的存活率，然而移植物的半寿期并未明显提高，慢性移植性肾病受到越来越多的关注。 慢性移植性肾病是远期移植物衰竭的最常见原因，其病因既涉及免疫学因素，又涉及非免疫性损伤。非免疫方面包括冷缺血，供肾疾病，年龄，慢性神经钙蛋白抑制剂毒性、感染。近年来，非免疫性损伤愈发受到重视。临床上亦发现活体不相关供肾，短期和长期效果好于尸体供肾，说明移植时肾脏质量和非免疫因素是关键。 冷缺血损伤是临床肾移植不可避免的病理生理过程，是慢性移植性肾病的危险因素之一。冷缺血时间越长，引发术后慢性排斥反应的可能性越大。冷缺血损害如何启动慢性移植性肾病，其机理不清楚，可能与低温本身损害、细胞因子、细胞代谢等多种因素有关。 肾间质纤维化是慢性移植性肾病病理改变的主要特点。转化生长因子β1(TGFβ1)是最关键的促纤维化生长因子，在几乎所有研究的慢性肾脏疾病模型中，TGFβ1的表达增强，TGFβ1还是许多其它因子(如Ang-Ⅱ)引起纤维化的介质。结缔组织生长因子(CTGF)为TGFβ1的下游因子，是肾小管间质纤维化的关键因子，在有肾小管间质纤维化，慢性肾间质损伤及移植排斥的病例，CTGFmRNA表达很强烈，阻断TGF-β的表达或者可以减轻组织纤维化，但可能引起细胞生长失控，免疫失调，严重炎症等副作用。因CTGF生物学效应单一，可能仅介导TGF-β的促纤维化效应，因此阻断CTGF表达可能是一种更特异，更有效的防治纤维化的手段。随着供体短缺的矛盾日益突出，供体标准的放宽，边缘性供体的使用，供体肾脏保存的损伤研究日益受到重视，深入研究供肾损伤的机制将有重要的积极的意义。 本研究主要目的是探讨冷缺血损伤对大鼠近端肾小管上皮细胞转化生长因子β1(TGFβ1)，结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响，进一步阐明供肾冷缺血损伤机制。 方法： 选择健康雄性Wistar大鼠40只，按供肾冷保存时间，随机分成5组：①冷保存0h组(对照组)，②冷保存12h组，③冷保存24h组，④冷保存36h组，⑤冷保存48h组。供肾切取采取原位灌注整块肾脏切取，0-4℃HC-A(离体肾保存液)灌注，并置于0-4℃冰灌注液中分别保存0h，12h，24h，36h，48h，通过光镜、透射电镜观察不同冷保存时间组近端肾小管上皮细胞形态及超微结构改变，并采用免疫组织化学术，原位杂交术分别检测不同冷保存时间组近端肾小管上皮细胞TGFβ1、CTGF蛋白及mRNA表达，图像分析仪计算其阳性单位(PU)值。单因素方差分析比较多组间PU值的差异。双变量相关分析(Pearson相关系数)分析TGF-β1与CTGF蛋白表达PU值，mRNAPU值之间的相关性。 结果： 1.不同冷缺血时间近端肾小管上皮细胞形态学及超微结构改变：冷保存12h组与对照组相似；冷保存24h组，部分近端肾小管上皮细胞出现轻度水变性；冷保存36h组近端肾小管上皮细胞出现明显水变性；冷保存48h组出现严重水变性及部分近端肾小管上皮细胞坏死、脱落。 2.不同冷缺血时间近端肾小管上皮细胞TGFβ1、CTGF蛋白表达 TGFβ1、CTGF蛋白表达均以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，TGFβ1、CTGF蛋白在冷保存0小时组，12小时组的近端肾小管上皮细胞几乎无表达，TGFβ1蛋白表达PU值分别为6.37±2.77，6.11±1.82，两组PU值相比较亦无差异(n=40，P=0.0878)；CTGF蛋白表达PU值分别为5.91±2.30，5.57±2.40，两组PU值相比较无差异(n=40，P=0.821)。随着冷缺血时间延长，24h组、36h组、48h组TGFβ1蛋白PU值逐渐增高，各组PU值分别为10.20±3.27，13.84±3.91，17.17±3.96，各组相互比较，有显著性差异(24h组与36h组相比较，n=40，P=0.031:24h组与48h组相比较，n=40，P=0.000；36h组与48h组相比较，n=40，P=0.047)，与对照组、12h组相比较亦均有显著差异(24h组与0h组相比较，n=40，P=0.024；24h组与12h组相比较，n=40，P=0.016；36h组与0h组相比较，n=40，P=0.000；36h组与12h组相比较，n=40，P=0.000：48h组与0h组相比较，n=40，P=0.000：48h组与12h组相比较，n=40，P=0.000)。24h组、36h组、48h组CTGF蛋白PU值亦逐渐增高，各组PU值分别为10.25±2.92，14.31±2.83，18.11±3.94，各组相互比较，有显著性差异(24h组与36h组相比较，n=40，P=0.012：24h组与48h组相比较，n=40，P=0.000：36h组与48h组相比较，n=40，P=0.016：)，与对照组、12h组相比较亦均有显著差异(24h组与0h组相比较，n=40，P=0.006：24h组与12h组相比较，n=40，P=0.003：36h组与0h组相比较，n=40，P=0.000：36h组与12h组相比较，n=40，P=0.000：48h组与0h组相比较，n=40，P=0.000：48h组与12h组相比较，n=40，P=0.000)。不同冷保存组TGFβ1，CTGF蛋白表达阳性单位存在正相关关系(n=40，r=0.674，P<0.05)。 3.不同冷缺血时间近端肾小管上皮细胞TGFβ1，CTGFmRNA表达 TGFβ1、CTGFmRNA均以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。TGFβ1、CTGFmRNA在0h组，12h组近端肾小管上皮细胞几乎无表达，TGFβ1mRNAPU值分别为5.29±2.15，5.90±2.40，两组PU值相比较无差异(n=40，P=0.706)。CTGFmRNAPU值分别为6.24±2.79，6.51±2.43，两组PU值相比较无差异(n=40，P=0.889)。随着冷缺血时间延长，24小时组、36小时组、48小时组TGFβ1mRNAPU值逐渐增高，分别为11.32±3.34，15.47±4.21，19.01±3.53，各组相互比较，有显著性差异(24h组与36h组相比较，n=40，P=0.014：24h组与48h组相比较，n=40，P=0.000；36h组与48h组相比较，n=40，P=0.035：)，与对照组、12小时组相比较亦均有显著差异(24h组与0h组相比较，n=40，P=0.001；24h组与12h组相比较，n=40，P=0.002；36h组与0h组相比较，n=40，P=0.000；36h组与12h组相比较，n=40，P=0.000；48h组与Oh组相比较，n=40，P=0.000；48h组与12h组相比较，n=40，P=0.000)。24小时组、36小时组、48小时组CTGFmRNAPU值亦逐渐增高，PU值分别为15.24±3.95，19.20±4.73，23.09±4.40，各组相互比较有显著性差异(24h组与36h组相比较，n=40，P=0.043；24h组与48h组相比较，n=40，P=0.000；36h组与48h组相比较，n=40，P=0.046；)，与对照组、12小时组相比较亦均有显著差异(24h组与0h组相比较，n=40，P=0.001；24h组与12h组相比较，n=40，P=0.002，；36h组与0h组相比较，n=40，P=0.000；36h组与12h组相比较，n=40，P=0.000；48h组与0h组相比较，n=40，P=0.000；48h组与12h组相比较，n=40，P=0.000)。不同冷保存组TGFβ1，CTGFmRNA阳性单位存在正相关关系((n=40，r=0.767，P<0.05)。 结论： 1.冷保存12h组与0h组供肾近端肾小管上皮细胞形态学改变相似，冷保存24h组，部分近端肾小管上皮细胞出现轻度水变性；说明冷保存24小时前形态变化不明显，较安全。 2.TGFβ1、CTGF蛋白及其mRNA在冷保存0小时组，12小时组的近端肾小管上皮细胞几乎无表达，随着冷缺血时间延长，冷保存24小时组，36小时组，48小时组TGFβ1、CTGF蛋白及其mRNA表达逐渐增高，同时冷保存24小时组部分近端肾小管上皮细胞出现轻度水变性，冷保存36h组出现明显水变性，冷保存48h组出现严重水变性及部分近端肾小管上皮细胞坏死、脱落。提示TGFβ1、CTGF蛋白及其mRNA表达与冷缺血损伤严重程度相关。表明TGFβ1、CTGF促进细胞外基质合成，可能在肾小管上皮细胞损伤的再生与修复起重要作用。TGFβ1，CTGF的过表达可能是启动慢性移植物性肾病的机制之一。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录1 供肾冷保存的研究进展（综述）

附录2 主要缩略词

附录3 硕士研究生期间发表论文情况

统计合格证明

致谢