2，3，7，8-四氯二苯并对二噁英对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞E、P分泌和氧化应激及凋亡的影响

摘要

近年，越来越多的流行病学研究资料表明野生动物和人类的生殖发育系统、免疫系统、神经系统和行为异常以及某些肿瘤的发生率上升与环境内分泌干扰物有关。其中2，3，7，8-四氯二苯并对二噁英(2，3，7，8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxinTCDD)毒性最大，在痕量(如人体每日摄入量为1-4pg／kg体重或更低)暴露剂量下便干扰整个机体的内分泌调节、损伤免疫系统、神经系统、诱发癌症等毒性作用，尤其具有雌激素样或抗雌激素样的内分泌干扰作用，造成严重的生殖与发育障碍。在人类生殖领域，不孕不育夫妇日益增多且很多仍面临当今医学尚无法解释的原因，这促使我们不得不思考TCDD等环境内分泌干扰物对人类生殖影响的程度和范围实际上可能远远超过我们既往的估计，人类的繁衍正面临着巨大的潜在威胁。然而，目前对TCDD生殖损害的阈值及机理还知之甚少，致使在临床上还未能采取有针对性的诊治措施。本研究采用TCDD染毒体外原代培养大鼠卵巢颗粒细胞，旨在探讨TCDD对大鼠卵巢颗粒细胞的毒性阈值与作用机制，验证TCDD是否通过诱导氧化应激来诱导颗粒细胞凋亡发生，而抑制卵巢颗粒细胞的甾体激素的合成和分泌，进而构成TCDD对人类生殖的毒性机制，从而为进一步探索临床防治措施提供应用基础性知识。 第一部分：TCDD对大鼠卵巢颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的影响 文献提示TCDD对人类生殖健康的影响主要是通过抑制卵巢甾体激素生成途径。关于TCDD抑制卵巢颗粒细胞E2的分泌已有定论，但其作用的具体剂量、机制和是否抑制P的分泌尚存在争议。本实验采用TCDD染毒体外培养大鼠卵巢颗粒细胞，检测TCDD对细胞活力和E2、P分泌的影响。 方法： ①25-29D雌性SD大鼠4只，腹腔注射孕马血清(PMSG)50IU，48h后对卵巢颗粒细胞进行原代培养。 ②细胞贴壁后换液继续培养24h，分别加入0.1、1、10、100nMTCDD刺激24h和10nMTCDD刺激0、1、3、6、18、24h，并设正常对照和0.1％DMSO阴性对照组。 ③采用MTT法检测各组细胞活力，RIA法检测各组收集培养液中的E2和P值。 ④每实验组均设三个复孔。 小结： ①TCDD显著抑制细胞活力，1nMTCDD刺激24h或10hMTCDD刺激3h即可明显降低细胞活性，提示TCDD对大鼠卵巢颗粒细胞的毒性作用阈值可能为1nM或更低。 ②TCDD明显抑制大鼠卵巢颗粒细胞E2和P分泌，大于1nMTCDD显著抑制大鼠卵巢颗粒细胞E2和P分泌，提示TCDD的生殖毒性作用可能与直接对卵巢颗粒细胞的毒性作用和抑制甾体激素的生物合成以及分泌有关。 ③TCDD抑制大鼠卵巢颗粒细胞活力和E2、P分泌具有剂量-时间依赖关系。 第二部分：TCDD诱导原代培养大鼠卵巢颗粒细胞的氧化应激和凋亡 许多研究报道TCDD通过氧化应激介导对一般细胞的毒性作用。但是，关于TCDD是否通过活性氧(ROS)机制诱导卵巢颗粒细胞凋亡并影响甾体激素分泌的研究未见报道。本研究探讨TCDD对体外原代培养大鼠卵巢颗粒细胞的氧化应激和凋亡的影响，进一步探索ROS在介导TCDD诱导颗粒细胞凋亡中的作用。 方法： ①25-29D雌性SD大鼠80只，对卵巢颗粒细胞进行原代培养。 ②细胞贴壁后继续培养24h，分别加入0.1、1、10、100nMTCDD刺激24h和10nMTCDD刺激不同时间段。并设正常对照组和0.1％DMSO阴性对照组 ③采用AnnexinV-FITC／PI双染流式检测不同剂量TCDD刺激24h和10nM刺激0、1、3、6、18、24h的细胞凋亡率；并采用TUNEL-FITC／Hoechst33258荧光双染进一步印证TCDD诱发颗粒细胞的凋亡。 ④检测10nMTCDD刺激0、0.5、1、5、24h后细胞内ROS、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平。 ⑤检测10nMTCDD联合50、100、150u／mlSOD刺激5h后细胞内ROS量以及10nMTCDD联合100u／mlSOD刺激0、1、3、6、18、24h的细胞凋亡率。 ⑥每实验组均设三个复孔。 小结： ①体外培养的大鼠颗粒细胞暴露于10nMTCDD1h或1nMTCDD24h早期凋亡发生显著增加，10、100nM剂量诱导晚期凋亡和细胞死亡增加明显。并且TCDD刺激18h前引起早期凋亡发生递增，而作用24h时主要诱导颗粒细胞晚期凋亡和细胞死亡的增加。具有剂量-时间依赖关系。采用TLINEL-FITC／Hoechst33258荧光双染对比印证TCDD诱导颗粒细胞的凋亡。提示TCDD引起颗粒细胞凋亡的阈值为1nM或更低。 ②10nMTCDD暴露不同时间均诱导颗粒细胞ROS生成增加显著，较对照组ROS增加达1.9-3.4倍不等，5h时达到顶峰，24h后降低到1h水平。且TCDD诱导卵巢颗粒细胞内MDA增加和GSH损耗与ROS生成一致。提示10nMTCDD刺激短时间即可诱导颗粒细胞的氧化损伤作用，具有时间依赖关系。 ③10nMTCDD刺激不同时间诱导颗粒细胞ROS生成和凋亡发生增加一致，且ROS抑制剂-SOD显著抑制TCDD诱导的大鼠颗粒细胞氧化损伤和凋亡，本实验首次提出TCDD通过ROS途径介导大鼠颗粒细胞凋亡，是颗粒细胞凋亡的早期机制。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分TCDD对大鼠卵巢颗粒细胞E2和P分泌的影响

1 材料和方法

2 结果

3讨论

4 小结

第二部分TCDD诱导原代培养大鼠卵巢颗粒细胞的氧化应激和凋亡

1材料和方法

2结果

3讨论

4 小结

全文小结

参考文献

附：文献综述 TCDD的生殖毒性作用

附录：中英文缩略词对照表

攻读学位期间成果

致谢

统计学审稿证明