肾衰养真胶囊对胰岛素诱导的脂肪细胞瘦素及C/EBPα表达的影响

摘要

背景： 营养不良是慢性肾衰竭(chronicrenalfailure，CRF)患者(包括透析和非透析)临床常见的重要并发症。国内报道65％以上终末肾脏病人发生营养不良。营养不良可加重免疫功能低下、贫血等，甚至导致多脏器衰竭，其发生不仅影响CRF患者的预后，而且与其死亡率密切相关。CRF营养不良研究成为近年来国际国内肾脏病领域研究的重点课题。瘦素(Leptin)是新近发现由肥胖基因(Obesegene，Obgene)编码的激素样蛋白，其分子量为16KD，主要功能是降低食欲，增加能量消耗，导致体重减轻。研究表明，Leptin与CRF关系密切，许多CRF患者，包括腹透、血透、肾移植的终末期肾衰患者均合并高Leptin血症。CRF时肾小球滤过率下降，肾脏清除能力下降是Leptin升高的主要原因。另外CRF患者代谢紊乱如高胰岛血症、炎症、高胆固醇血症等均可上调Leptin基因的表达，导致体内Leptin升高。研究发现，CRF透析患者血Leptin与体脂含量之比与患者蛋白质摄入量呈显著负相关，与血清白蛋白、转铁蛋白呈负相关，与蛋白分解率呈负相关，提示Leptin与营养不良关系密切。目前国内许多学者亦发现Leptin与CRF营养不良关系密切，是导致CRF患者厌食和营养不良的重要因素，但缺乏深入的细胞分子机制研究。 Leptin由脂肪细胞合成后以内分泌、自分泌或旁分泌的形式作用于分布在多个部位的OB-R，从而发挥一系列效应。包括：抑制食欲、减少能量摄取；增加交感神经系统的活性，使大量贮存的能量转变成热能释放，产热增加：加重胰岛素抵抗，对胰岛素的合成、分泌发挥负反馈调节等。CRF患者体内存在的高瘦素血症可引起患者食欲抑制，能量消耗增加，体重减轻，导致CRF患者营养不良。 由于CRF营养不良病因病机十分复杂，CRF营养不良临床治疗显得十分棘手，不可能找到特异性的药物。西医方面，一是替代疗法，如静滴氨基酸、白蛋白、能量合剂、水溶性维生素，注射重组生长激素及IGF-1，氨基酸透析等处理，以上疗效短暂有限且价格昂贵。二是口服药物开同(主要成分为复方a-酮酸片)，开同是一种必需氨基酸和酮酸的混合制剂，其本身不含氮，在蛋白合成过程中利用尿素，其疗效亦有限且价格较贵。以上均不适合我国国情，难以得到普遍应用，寻求一种经济有效的治疗方法迫在眉睫。中医药能有效改善营养不良，且在药效上各有侧重，作用机理和途径也有所不同，因此，积极寻求改善CRF营养不良的中药具有重要意义。 目的： 观察肾衰养真胶囊含药血清对胰岛素诱导的脂肪细胞瘦素及C/EBPa表达的影响，探讨肾衰养真胶囊改善CRF营养不良的机制。 方法： 1.药物血清制备：通过给予大鼠分别灌服中药肾衰养真胶囊、开同和生理盐水制备肾衰养真胶囊含药血清、阳性对照开同含药血清和空白血清。 2.脂肪细胞培养分组：原代培养大鼠前脂肪细胞，诱导分化为成熟脂肪细胞，通过油红O染色鉴定为脂肪细胞。脂肪细胞随机分为5组：正常细胞组、胰岛素刺激组、空白血清组、中药血清组和开同血清组，每组6孔，以相应的试剂及药物血清干预48小时后，吸取上清，并提取细胞总RNA。 3.放免法检测细胞上清Leptin分泌水平。 4.RT-PCR法检测脂肪细胞OBmRNA和C/EBPamRNA表达：Trizol法提取和纯化脂肪细胞总RNA，以0.1％DEPC处理水50μl溶解后分装，加RNAin保存于-80℃冰箱。设计OB、C/EBPa及内参GAPDH引物序列，取总RNA5μl进行逆转录，42℃，60分钟形成cDNA，94℃，5分钟，灭活逆转录酶，然后进行PCR扩增。取扩增产物5μl，加上样缓冲液1μl，在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，缓冲液为0.5xTBE电泳缓冲液，恒定电压90v，80分钟。于紫外灯下拍照，将胶片上反应带在凝胶成像分析系统中扫描、分析电泳带的灰度。目的基因mRNA表达量=每例标本目的基因凝胶图像平均灰度值/同一标本GAPDH凝胶图像平均灰度值。 结果： 1.前脂肪细胞经激素、IBMX、胰岛素诱导后可分化为成熟脂肪细胞，镜下观察细胞形态上由纤维状梭形变成椭圆形圆形，胞质中出现脂肪滴，随着分化程度的加深，脂肪滴逐渐变大，油红O染色见胞浆内脂滴呈橘红色。 2.各组细胞瘦素分泌水平的变化：脂肪细胞经胰岛素处理48h后，胰岛素刺激组细胞Leptin分泌量较正常细胞组显著增高(P=0.001)。经药物血清干预后，中药血清组细胞Leptin分泌量较胰岛素刺激组显著降低(P=0.027)，开同血清组与胰岛素刺激组比较无统计学差异(P=0.512)，中药血清组细胞Leptin分泌量较开同血清组降低，但无统计学意义(P=0.104)。 3.各组细胞OBmRNA的表达：各组间OBmRNA相对表达量比较具有显著性差异(F=10.323，P<0.001)。胰岛素刺激组细胞OBmRNA相对表达量较正常细胞组显著增高(P<0.001)，中药血清组与胰岛素刺激组相比较，脂肪细胞中OBmRNA表达水平显著下调(p=0.005)；开同血清组OBmRNA表达水平较胰岛素刺激组降低，但无统计学差异(P=0.433)；中药血清组与开同血清组比较OBmRNA表达显著下调(p=0.033)。 4.各组细胞C/EBPamRNA的表达：各组间C/EBPamRNA相对表达量比较具有显著性差异(F=5.421，P=0.003)。胰岛素刺激组细胞C/EBPamRNA相对表达量较正常细胞组显著增高(P=0.001)，中药血清组与胰岛素刺激组相比较，脂肪细胞中C/EBPamRNA表达水平显著下调(P=0.002)；开同血清组C/EBPa表达水平较胰岛素刺激组降低，但无统计学差异(P=0.260)。 结论： 肾衰养真胶囊药物血清可直接作用于脂肪细胞，通过抑制胰岛素刺激引起的脂肪细胞OBmRNA和C/EBPamRNA的高表达，抑制Leptin的过度分泌。这可能是肾衰养真胶囊改善CRF营养不良的重要机制之一，从而为其临床应用及新药开发提供了实验依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章：肾衰养真胶囊对胰岛素刺激的大鼠脂肪细胞Leptin表达的影响

材料

方法

结果

讨论

第二章：肾衰养真胶囊对胰岛素刺激的大鼠脂肪细胞C/EBP α表达的影响

材料

方法

结果

讨论

全文小结（Brief summary）

参考文献

综述体外脂肪细胞培养的研究现状

附录

攻读硕士学位期间成果

致谢

统计学审稿证明