晚期氧化蛋白产物通过NADPH氧化酶介导刺激大鼠肾系膜细胞过度表达细胞外基质

摘要

研究背景： 本研究室既往的研究发现AOPP在5/6肾切除和糖尿病大鼠模型中通过NADPH氧化酶介导加速肾脏纤维化。为了进一步研究AOPP加速肾小球硬化的分子机制，我们以体外培养的大鼠肾小球系膜细胞作为肾脏系膜细胞的模型，观察氧化修饰的大鼠白蛋白是否通过NADPH氧化酶信号通路信号转导途径上调炎症因子并导致细胞外基质的积聚。 研究方法： 一、AOPP的制备将 AOPP含量通过测定酸性条件下340nm的光吸收，以氯胺T为标准取得。通过鲎试验法检测，该方法制备的AOPP无内毒素。 二、大鼠系膜细胞的培养 大鼠肾小球系膜细胞购自武汉保藏中心。细胞复苏后在37℃、5％CO2条件下用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，待细胞生长至80％融合时用于实验。 三、细胞上清中四型胶原、纤维连接蛋白、转化生长因子及结缔组织生长因子浓度的测定 RMCs生长至融合，在阻断实验中，细胞分别与NAD(P)H氧化酶抑制剂apocynin和DPI预孵育1小时，用200μg/mlAOPP刺激48小时。收集细胞上清并进行细胞计数。ELISA法检测四型胶原、纤维连接蛋白、转化生长因子及结缔组织生长因子在细胞上清中的浓度，以细胞数矫正。 四、四型胶原、纤维连接蛋白、转化生长因子及结缔组织生长因子mRNA表达的检测 在阻断实验中，细胞分别与NAD(P)H氧化酶抑制剂apocynin和DPI预孵育1小时，用200μg/mlAOPP刺激48小时，加入Trizol试剂提取细胞总RNA。 五、NADPH依赖的超氧阴离子的检测 在阻断实验中，细胞分别与NAD(P)H氧化酶抑制剂apocynin100、DPI、线粒体酶复合体1抑制剂rotenone、线粒体酶复合体2抑制剂TTFA、黄嘌呤氧化酶抑制剂aUopurinol、NO合酶抑制剂L-NAME及超氧化物歧化酶SOD预孵育1小时，用200μg/mlAOPP刺激3h，收集细胞。用光泽精化学发光法检测细胞内的超氧阴离子。 六、p47phox磷酸化的检测 免疫沉淀及WesternBlotting检测p47phox磷酸化及总的p47phox蛋白含量。 七、p22phox-p47phox以及p22phox-NOX4结合的检测 RMCs分别与200μg/mlAOPP或200μg/ml未经修饰的RSA共同孵育0、5、15、30及60min，收集细胞总蛋白。 八、p47phox的膜迁移 RMCs分别与200μg/mlAOPP或未经修饰的RSA孵育30rain，用免疫荧光法观察P47phox的膜迁移。 九、p47phox、p22phox及NOX4蛋白的表达 提取细胞总蛋白，WesternBlotting检测p22phox、p47phox和NOX4的表达。 十、统计方法 所有数据均代表3次重复实验的结果，以均数±标准差表示。所有统计由统计软件SPSS12.0完成。多个样本均数的比较采用One-WayANOVA，两两比较采用LSD和SNK，P<0.05为差异有统计学意义。 结果： 一、AOPP的鉴定制备的次氯酸修饰的大鼠血清白蛋白和未经修饰的大鼠血清白蛋白的蛋白浓度分别为9.5mg/ml和10.3mg/ml，AOPP含量分别为700μmol/1和1.56μmol/1，经蛋白浓度矫正后分别为73.7nmol/mg蛋白和0.15nmol/mg蛋白。所有制备的AOPP或未经修饰的RSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。 二、AOPP对细胞外基质纤维连接蛋白和四型胶原的影响 (一)AOPP对纤维连接蛋白的影响 1.AOPP对大鼠系膜细胞纤维连接蛋白分泌的影响 AOPP与RMCs共同孵育12、24、48及72小时后，细胞上清中分泌的纤维连接蛋白含量上调，呈时间依赖性。并且随着AOPP剂量的增加，上述蛋白表达亦逐渐增加，未经修饰的大鼠血清白蛋白对纤维连接蛋白的分泌无明显影响。 2.AOPP对大鼠系膜细胞纤维连接蛋白mRNA表达的影响 AOPP与RMCs共同孵育0、12、24、48和72小时后，纤维连接蛋白mRNA表达随刺激时间的延长而升高，呈时间依赖性。同时，AOPP以剂量依赖的方式上调RMCs表达纤维连接蛋白mRNA。未被修饰的大鼠血清白蛋白对RMCs表达纤维连接蛋白mRNA无明显影响。 (二)AOPP对四型胶原的影响 1.AOPP对大鼠系膜细胞四型胶原蛋白分泌的影响 AOPP与RMCs共同孵育0、12、24、48和72小时后，细胞上清中四型胶原蛋白的分泌随刺激时间的延长而升高，呈时间依赖性。同时，AOPP以剂量依赖的方式诱导RMCs分泌collagenIV。未经修饰的大鼠血清白蛋白对四型胶原的分泌无明显作用。 2.AOPP对大鼠系膜细胞四型胶原mRNA表达的影响 AOPP与RMCs共同孵育0、12、24、48和72d,时后，四型胶原mRNA表达均随刺激时间的延长而升高，呈时间依赖效应。同时，AOPP以剂量依赖的方式诱导RMCs四型胶原mRNA的表达.未被修饰的RSA对RMCs表达四型胶原mRNA无明显影响。 三、AOPP对细胞因子和结缔组织生长因子的影响 (一)AOPP对转化生长因子的影响 1.AOPP对大鼠系膜细胞转化生长因子分泌的影响 AOPP与RMCs共同孵育0、12、24、48及72d,时后，细胞上清中TGF-β1的分泌随刺激时间的延长而升高，呈时间依赖效应。同时，AOPP以剂量依赖的方式刺激大鼠系膜细胞TGF-β1的分泌。未被修饰的RSA对大鼠系膜细胞TGF-β1的分泌则无明显影响。 2.AOPPX对大鼠系膜细胞转化生长因子mRNA表达的影响 AOPP与RMCs共同孵育0、12、24、48及72小时后，RMCsTGF-β1mRNA表达随刺激时间的延长而升高，呈时间依赖性。同时，AOPP以剂量依赖的方式上调大鼠系膜细胞TGF-β1mRNA的表达。未被修饰的RSA对大鼠系膜细胞TGF-β1mRNA表达无明显影响。 (二)AOPP对结缔组织生长因子的影响 1.AOPP对大鼠系膜细胞结缔组织生长因子分泌的影响 AOPP与RMCs共同孵育0、12、24、48及72小时后，CTGF的分泌随刺激时间的延长而升高，呈时间依赖性。同时，AOPP以剂量依赖的方式增加大鼠系膜细胞CTGF的分泌。未被修饰的RSA对大鼠系膜细胞CTGF蛋白分泌无明显影响。 2.AOPP对大鼠系膜细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响 AOPP与RMCs共同孵育0、12、24、48及72小时后，CTGFmRNA表达随刺激时间的延长而升高，呈时间依赖性。同时，AOPP以剂量依赖的方式上调大鼠系膜细胞CTGFmRNA的表达。未被修饰的RSA对大鼠系膜细胞CTGFmRNA表达无明显影响。 四、AOPP对系膜细胞超氧阴离子产生的影响 AOPP刺激系膜细胞后能显著升高细胞内O2-的产生，并呈时间和剂量依赖效应。未被修饰的RSA对大鼠系膜细胞O2-的产生无明显影响。NADPH氧化酶抑制剂能明显抑制O2-的产生，而线粒体酶复合体1抑制剂rotenonc、线粒体酶复合体2抑制剂TTFA、黄嘌呤氧化酶抑制剂allopurinol、NO合酶抑制剂L-NAME均不能抑制O2-的产生。 五、AOPP对系膜细胞NADPH氧化酶的激活作用 (一)AOPP诱导p47phox磷酸化AOPP刺激系膜细胞5min、15min、30min及60min后，能引起p47phox的磷酸化，并在30min时最明显。而在60min以内，p47phox的总蛋白含量未发生变化。 (二)AOPP诱导p47phox与p22phox及NOX4结合AOPP刺激系膜细胞5min、15min、30min及60min后，p47phox与p22phox和NOX4结合明显增多，表明能使p47phox迁移至膜上。而在60min以内，p22phox及NoX4的总蛋白含量未发生变化。 (三)AOPP诱导p47phox的膜迁移 AOPP刺激系膜细胞30min后，用免疫荧光检测出现明显的p47phox膜迁移。 (四)AOPP对系膜细胞NADPH氧化酶亚基表达的影响 AOPP刺激系膜细胞0、6、12和24h后，p47phox、p22phox和NOX4表达均上调，并呈时间依赖效应。 六、NADPH氧化酶抑制剂DPI及APO对AOPP诱导的系膜细胞的生物学效应的影响。 大鼠系膜细胞与DPI及APO预孵育一个小时后，加入200μg/mlAOPP刺激，AOPP对系膜细胞所产生的生物学效应均能被明显抑制，包括细胞外基质和炎症因子蛋白分泌的减少及mRNA表达的下调。进一步证实AOPP通过NADPH氧化酶途径诱导细胞功能障碍。 结论： 本研究证实，AOPP通过激活系膜细胞NADPH氧化酶，诱导细胞氧化应激，促进炎症反应，导致细胞外基质的沉积，提示AOPP对系膜细胞的病理生理效应可能在DN发生发展过程中发挥重要作用。

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