实验用西藏小型猪SLA-DQA、DQB基因的多态性研究及其序列分析

摘要

主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)是由一群紧密连锁高度多态的基因位点组成的染色体上的一个基因系统。MHC在脊椎动物机体的免疫应答中具有重要作用，它不仅编码移植抗原，控制移植排斥反应，还参与免疫应答调控和免疫识别，其中最重要的功能是抗原递呈。MHC中的基因具有丰富的多态性，而且与疾病的易感性以及动物的生产性能之间具有非常密切的关系，是物种起源、进化和动物抗病育种的候选标记基因。 猪的MHC又称为白细胞抗原(SwineLymphocyteAntigen，SLA)，主要分为Ⅰ、Ⅱ、III类，由于SLAII类抗原主要是针对外源性抗原发挥免疫作用，和猪的抗病力强弱有紧密的联系。目前，在SLAII中已进行物理定位的基因或基因簇有：DRA、DRB、DQA、DQB等。人类的主要组织相容性抗原系统称为HLA，而在小鼠则称为H-2，SLA与人HLA和H-2都具有一定相似性。近年来国外很多学者对实验用猪的SLA及其遗传背景和特征进行了深入的研究，并为阐明人类免疫系统识别猪源异种组织抗原的机制奠定了理论基础。而国内在该方面的研究起步较晚，对于适用异种移植的中国猪种SLA基因结构，及其在猪-人异种器官移植研究中的作用报道不多。 南方医科大学实验动物中心自2004年从西藏工布江达县引入50头原种西藏小型猪，经过四年多的培育，不仅完成风土驯化过程，而且实现了实验动物化培育，获得了广东省科技厅颁发的实验用普通级小型猪合格证(实验动物许可证号：SCXK(粤)2006-0015；合格证号：粤监证字2006A055)。目前，已有500多头的种群规模，本研究即以我校实验动物中心自行培育的实验用西藏小型猪为研究对象。采用随机抽样的方法获得60头西藏小型猪血液样品，运用比较基因组以及PCR的方法成功获得了位于猪7号染色体上MHCII类区中SLA-DQA和SLA-DQB基因的第2外显子的片段(包括完整的第2外显子、部分第2内含子和少部分第1内含子)。采用限制性核酸内切酶对扩增产物进行酶切，并经电泳成像分析这两个基因的酶切带型，辨别和计算不同的基因型、等位基因的频率。对各酶切位点的带型分布进行卡方适合性检验，判定各个位点上的基因频率是否达到Hardy-Weiberg平衡态。同时将检验结果与文献中报道的其他品种小型猪进行比较，以探求西藏小型猪在这些基因位点是否发生突变或有其独特的基因性状。将PCR产物进行纯化克隆，对克隆酶切产物进行直接测序，获得了西藏小型猪MHCII类区中SLA-DQA，SLA-DQB基因第2外显子的核苷酸序列，并与GenBank中收录的其他品种猪、人、小鼠以及犬的SLA-DOA,SLA-DQB基因相应序列进行比对分析，探讨他们之间的同源性关系以及西藏小型猪的起源和遗传进化机制。 在本研究中，采用EcoRI和AluI对SLA-DQA基因进行酶切，结果各得到三种基因型(AA、AB和BB;MM、MN和NN)和两个等位基因(A和B;M和N)。经EcoRI酶切后，以纯合子BB基因型居多，得出的AA、AB和BB三种基因型的频率分别为23.333％、31.667％和45.000％，其中B为优势等位基因(60.833％)；经AluI酶切后，所得的三种基因型频率分布为MN型(50.000％)分别高于MM型(30.000％)和NN型(20.000％)，其中M为优势等位基因(55.000％)。综合双酶切结果，共出现7种组合带型，分别是：AAMM、AANN、ABMM、.ABMN、ABNN、BBMM和BBMN，其中BBMN组合带型出现的频率最高(30.000％)，暂未发现.AANN以及BBNN两种组合带型。 采用HaeIII和RsaI对SLA-DQB基因进行酶切，结果显示，经HaeIII酶切得出四个等位基因(A、B、C、D)和五种基因型(AA、BB、BC、DD、AD)。SLA-DQB基因第2外显子在HaeIII-RFLP位点以BC基因型居多(33.333％)，B为优势基因(33.333％)；经RsaI酶切共得出三个等位基因(E、F、G)和五种基因型(EE、EF、EG、FF、GG)。在RsaI-RFLP位点上，以EF基因型居多(33.333％)，E为优势等位基因(48.333％)。本实验中，西藏小型猪SLA-DQB基因共存在7种PCR-RFLP组合基因型，分别是：AAEE、AAFF、ADEG、ADGG、BBEE、BCEF和DDGG，其中HaeIII-RFLP位点上的BC基因型频率与RsaI-RFLP位点上的EF基因型频率完全对应，其组合带型BCEF出现的频率最高(33.333％)。 多态信息含量(PIC)计算结果表明：西藏小型猪在SLA-DQA和SLA-DQB两个基因上分别表现出中度多态(0.250.5)。经卡方适合性检验显示，西藏小型猪SLA-DQA在EcoRI酶切位点达到了Hardy-Weiberg平衡态(x2=4.300，P>0.05，a=0.05)，而在AluI酶切位点没有达到Hardy-Weiberg平衡态(x2=8.400，P<0.05，a=0.05)；SLA-DQB基因的HaeIII和RsaI酶切位点基因频率x2值(分别为7.200和2.933)在a=0.05水平上均未达到显著水平，表明DQB基因该两个位点处于遗传平衡状态。 采用克隆测序发分布获得了SLA-DQA、DQB基因第2外显子的核苷酸序列，在所得序列中分别检测到EcoRI、AluI的酶切位点碱基序列：5’…G↓AATTC…3’和5’…AG↓CT…3’，以及HaelII、RsaI的酶切位点碱基序列：5’…GG↓CC…3’和5’…GT↓AC…3’，测序结果进一步表明所获得的PCR扩增产物即为目的基因片段。其中，DQB序列第2外显子的G+C含量为64.83％，而DQA第2外显子的G+C含量较低，仅为45％。将测序结果与GenBank中收录的SLA-DQA、DQB基因全序列以及人的HLA-DQA、DQB序列等进行BLAST比对，结果发现西藏小型猪SLA-DQA序列与GenBank中收录的登录号为BX088590的猪序列同源性高达99％，仅在第83(C→T)和131位点(T→A)两个碱基发生变异。该序列与人(XM001129369)和小鼠(NM_010378.2)的DQA相应序列同源性分别为83％和71％。这比吴群(2004)研究报道的五指山小型猪以及云南版纳小耳猪SLA-DQA基因与相应HLA高频等位基因的同源百分数(分别为80.87％和81.96％)略高。西藏小型猪SLA-DQB序列与GenBank中收录的登录号为AY769655(藏猪)、AY769646(金华猪)以及AY626114(云南野猪)的序列同源性高达98.2％，变异位点均只有一个，其中前两者都是在第26位点有T→A的变异，而云南野猪则在第67位点有G→C的变异。该序列与人的HLA-DQB1*0305GR以及HLA-DQB1*03011等位基因的同源性分别为82.4％和81.7％，该结果比吴群研究报道的五指山小型猪以SLA-DQB基因与相应HLA高频等位基因的同源百分数(79.31％)略高，但略低于云南版纳小耳猪的同源百分数(82.38％)。 通过本研究得出以下结论： 本中心实验用西藏小型猪群体SLA-DQB基因第2外显子相对于SLA-DQA具有更丰富的多态性。西藏小型猪在这两个基因的酶切位点以纯合子酶切带型占优势，提示西藏小型猪群体这两个基因已经达到较高纯合度，作为实验动物应用于生命科学研究具有独特的优越性。 对各酶切位点基因型进行卡方适合性检验，仅AluI酶切位点基因型分布不符合Hardy—Weinberg平衡定律，这可能是由于西藏小型猪在特定的气候环境下长期进化选择的结果，是否与其特异的高抗逆性具有直接关联，尚待进一步证明。 采用PCR产物克隆测序法获得了SLA-DQA、DQB基因第2外显子的核苷酸序列，与其它猪种比对发生了某些位点的变异，与人的HLA相应序列同源性高于五指山猪和版纳小耳猪，也高于小鼠。提示，实验用西藏小型猪更适合于用作异种移植相关研究。 遗传进化树聚类分析表明，西藏小型猪与太湖猪以及云南野猪的亲缘关系较国内其它猪种近。这为追溯西藏小型猪的种系发生，和研究其遗传进化机制提供了重要线索。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写略词表及英汉对照

声明

第1章文献综述

1.1 MHC的发现

1.2 MHC分子的结构

1.3 MHC的分类及遗传特性

1.3.1 MHC的分类及数目

1.3.2 MHC分子的遗传特性

1.4 MHC产物与基因的分型方法

1.5 MHC与性状间的联系

1.5.1 SLA与猪的抗病性和经济性状

1.5.2 SLA与繁殖性状的关联

1.6 MHC在医学上的意义

1.6.1 MHC与在免疫识别及免疫细胞的分化

1.6.2 MHC与临床疾病的关系

1.6.3 MHC与器官移植

1.7 SLAII类基因的结构功能和多态性研究进展

1.7.1 SLA Ⅱ类基因的结构和功能

1.7.2 SLA Ⅱ类基因的多态性研究进展

第2章西藏小型猪SLA-DQA、DQB基因的PCR-RFLP分析

2.1本研究的目的和意义

2.2材料与方法

2.2.1实验动物

2.2.2主要仪器设备

2.2.3主要试剂

2.2.4主要试剂配制

2.2.5实验方法

2.2.6统计分析

2.3结果

2.3.1基因组DNA的抽提结果

2.3.2 PCR扩增及其产物电泳鉴定

2.3.3 SLA-DQA、DQB基因的PCR-RFLP多态性分析

2.3.4基因型及基因频率的分布

第3章西藏小型猪SLA-DQA、DQB基因的克隆及其序列分析

3.1材料与仪器

3.1.1材料

3.1.2主要仪器及设备

3.2实验方法

3.2.1 SLA-DQA、DQB基因PCR产物的纯化、克隆

3.2.2 DNA序列测定及比对分析

3.3结果

3.3.1 SLA-DQA、DQB外显子2重组质粒的酶切鉴定结果

3.3.2 SLA-DQA、DQB基因第2外显子的序列测定及比对分析

第4章讨论

4.1关于实验方法的选择

4.2关于目的基因和内切酶的选择

4.3 SLA-DQA和SLA-DQB基因的多态性

4.3.1 SLA-DQA基因第2外显子的EcoR I和Alu I酶切多态性

4.3.2 SLA-DQB基因第2外显子的HaeⅢ和Rsa I酶切多态性

4.3.3 SLA-DQA、DQB基因的RFLP遗传多态分析

4.4 SLA-DQA和SLA-DQB基因的应用前景

4.4.1 SLA-DQA及DQB基因与动物抗病力的相关性

4.4.2 SLA与猪器官的人源化改造应用研究

全文小结

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢