人尿激肽原酶对局灶性脑缺血模型大鼠侧枝循环影响的研究

摘要

目前脑血管疾病已成为危害我国中老年人身体健康和生命的主要疾病，急性脑梗死患者的死亡率和致残率较高，严重威胁了人类健康。梗塞灶由缺血中心区和周围的缺血半暗带区组成，缺血半暗带区内受损的神经细胞功能处于可逆状态。如何尽快建立缺血半暗带区的侧枝循环，挽救可逆性损伤的神经元细胞，成为国内研究的热点。 激肽系统广泛存在于动物体内的多个系统内，其对急性缺血性脑血管疾病有保护作用。组织激肽原酶是激肽系统的一个重要组成部分，其通过激肽B2受体介导，在脑组织急性缺血缺氧时有抗氧化、抗炎、抗凋亡、促进神经再生的作用。 人尿激肽原酶是从健康男性尿液中提取得到的蛋白水解酶，是组织激肽原酶的一种，有动物实验证明其能显著改善急性局灶性脑缺血实验大鼠的神经功能损伤症状，减小梗塞面积，并且能减轻脑水肿。但关于人尿激肽原酶对梗塞后脑血管再通、侧枝循环形成情况和神经功能再建机制还缺少详实的实验研究。为了解释以上问题，本文展开了以下的研究工作。 第一部分 局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的建立 目的：用线栓法建立实验大鼠脑缺血再灌注模型，探讨线栓法能否成功的建立脑缺血再灌注实验大鼠模型。 方法： 1.线栓法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型及分组 选择健康雄性SD大鼠8只，体重限制在280～350g，购于南方医科大学实验动物中心。采用Longa等改进的线栓法制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)。栓线选择直径为2.4～2.6mm的进口鱼线。 用随机法将8只实验大鼠随机分成两组：手术组、假手术组，每组4只。假手术组实验大鼠除不插栓线外，其余手术步骤同手术组大鼠。 2.5级4分制评分标准评定神经功能受损程度 分别在缺血再灌注术后4h，12h，24h，48h，72h对手术组、假手术组大鼠进行神经功能评分，观察实验大鼠术后神经功能改变情况。参考ZeaLonga的5级4分法评分标准：0分：正常，无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分，向对侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。 3.TTC染色 正常实验大鼠脑组织TTC染色后，呈红色；梗死区域为白色。 结果： 1.神经功能影响评定： 于缺血再灌注术后4h，12h，24h，48h，72h五个时间点观察手术组、假手术组实验大鼠神经功能改变情况。手术组实验大鼠：术后静息状态下对侧肢体不能外展，以前肢为著，肌张力下降。提尾实验对侧前肢屈曲，自发运动减少。行走时向对侧转圈，严重者向对侧倾倒，不能自发行走。术侧可伴有Honer征，表现为术侧眼裂、瞳孔变小。随时间推移，以上症状逐渐减弱或消失。假手术组实验大鼠术后均未出现以上神经功能损伤症状。 2.TTC染色： 手术组实验大鼠TTC染色后，术侧大脑半球脑组织出现白色梗死区，非术侧大脑半球脑组织均为红色。假手术组实验大鼠脑组织TTC染色后未见白色梗死区。 结论：线栓法能够成功的建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，为下一步实验奠定了基础。 第二部分 人尿激肽原酶对局灶性脑缺血再灌注大鼠侧枝循环形成影响的研究 目的：探讨人尿激肽原酶对局灶性脑缺血再灌注大鼠侧枝循环形成有无影响。 方法： 1.建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型及分组 选择健康雄性SD大鼠56只，体重限制在280～350g，购于南方医科大学实验动物中心。用随机法将56只SD大鼠分为三组：假手术组(SH)、生理盐水组(NS)、人尿激肽原酶组(HUK)。其中生理盐水组、人尿激肽原酶组各24只大鼠，分别于缺血90min再灌注6h、12h、24h、72h、7d取脑，24h时间点8只大鼠(4只取脑后行TTC染色、另外4只取脑后作冰冻切片行免疫组化及HE染色)，余时间点各4只大鼠(取脑后行免疫组化及HE染色)；假手术组8只大鼠(4只取脑后行TTC染色，另外4只取脑后行免疫组化及HE染色)，术后24h取脑。 人尿激肽原酶组、生理盐水组实验大鼠于缺血再灌注3h、后每天一次经大鼠尾静脉分别给予人尿激肽原酶或生理盐水。人尿激肽原酶组试验大鼠给药剂量：将人尿激肽原酶用生理盐水稀释成17.5×10-3PNAU/ml，用药量为1.0ml/kg；生理盐水组实验大鼠用药剂量亦为1.0ml/kg；假手术组不给予尾静脉给药。 2.神经功能评定 参考ZeaLonga的5级4分法评分标准，分别在缺血再灌注术后4h，12h，24h，48h，72h五个时间点，对三组实验大鼠进行神经功能评分。观察三组实验大鼠在不同时间点神经功能损伤程度有无差别。 3.TTC染色及脑梗死体积测定 TTC染色后，应用HPIAS21000病理图文分析系统测量各层面积及脑梗死面积，由公式： V=∑(A1+A2)t/2(其中t为切片厚度，A1和A2分别表示切块嘴、尾侧梗死面积)换算出梗死体积。 4.HE染色、光镜检查 5.VEGF、f8因子相关抗体免疫组化 采用免疫组化ABC方法染色。将抗VEGF多克隆抗体按1:100稀释；抗f8因子抗体按1:200稀释。 6.统计学分析 所有数据均采用SPSS11.0软件处理，实验数据以x±s表示。 ①析因分析统计学方法：实验大鼠半暗带区VEGF免疫组化染色阳性细胞计数、半暗带区VEGF免疫组化染色阳性血管计数及f8免疫组化染色阳性血管计数结果分析。 ②两样本t检验统计学方法：实验大鼠脑梗死体积测量结果分析。 ③非参数检验统计学方法：实验大鼠神经功能影响评分评定结果分析。 结果： 1.神经功能影响评定结果 人尿激肽原酶组和生理盐水组实验大鼠间神经功能评分有显著性差异。缺血再灌注4h、12h、72h人尿激肽原酶组与生理盐水组实验大鼠间神经功能评分无显著差异，P>0.05：缺血再灌注24h、48h人尿激肽原酶组与生理盐水组实验大鼠间神经功能评分有显著差异，P<0.05。人尿激肽原酶可以在缺血早期减轻缺血再灌注实验大鼠的神经功能损伤程度。 2.TTC染色、脑梗死体积测定结果 人尿激肽原酶组和生理盐水组实验大鼠术侧大脑半球脑组织出现白色梗塞区，非术侧大脑半球脑组织呈现鲜红色。但人尿激肽原酶组实验大鼠术侧大脑半球脑组织白色梗死区范围较生理盐水组小。假手术组实验大鼠双侧大脑半球脑组织均无白色梗死区。 人尿激肽原酶组与生理盐水组实验大鼠脑组织梗塞体积间有显著性差异，P<0.05。 3.光镜检查结果 人尿激肽原酶组实验大鼠术侧大脑半球脑组织，于缺血再灌注6h、12h见大脑皮层锥体细胞略有肿大，胞浆淡染；缺血再灌注24h，部分锥体细胞缩小，胞核深染，胶质细胞增生；缺血再灌注72h，出现严重的细胞死亡，缺血中心区组织疏松，形似海绵状，表现为神经细胞胞体溶解，胞浆淡染，胞核固缩，梗死灶周围胶质细胞明显增多；缺血再灌注7d，部分细胞体积缩小，胞浆及胞核浓染，胶质细胞增生，可见新生毛细血管。生理盐水组实验大鼠各实验时间点脑组织损伤表现同人尿激肽原酶组，但损伤程度均重于人尿激肽原酶组。假手术组实验大鼠脑组织光镜下未见异常。 4.VEGF、f8因子相关抗体免疫组化染色及图像分析结果 ①人尿激肽原酶组实验大鼠脑组织梗塞中心和梗塞周边均有VEGF免疫阳性表达细胞，非缺血侧大脑组织无阳性表达细胞，表达VEGF的细胞为神经细胞、胶质细胞和巨噬细胞，72h后梗塞中心区以胶质细胞表达为主，72h、7d有大量新生血管内皮细胞表达VEGF。随着缺血时间的延长阳性表达细胞增多，24h进入表达高峰期，7d表达减少。生理盐水组VEGF表达的规律同人尿激肽原酶组，但在各时间点VEGF表达阳性细胞数均低于人尿激肽原酶组，两组间差异有显著差异，P<0.05。假手术组实验大鼠脑组织无VEGF阳性表达细胞。 ②人尿激肽原酶组实验大鼠脑组织梗塞中心及梗塞周边f8因子阳性表达血管数6h开始减少，随着再灌注损伤时间的延长f8因子阳性表达血管数继续减少，至72h表达开始增加。生理盐水组f8因子免疫组化染色表达规律同人尿激肽原酶组，但其表达水平低于人尿激肽原酶组。人尿激肽原酶组与生理盐水组实验大鼠f8免疫组化染色阳性表达血管计数间差异有显著性意义，P<0.05。假手术组实验大鼠双侧大脑半球脑组织f8因子表达无差异。 结论：人尿激肽原酶可以减轻急性缺血再灌注大鼠模型神经功能损伤程度、减少脑梗死面积，促进缺血半暗带区侧枝循环形成。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的建立

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

第二部分 人尿激肽原酶对局灶性脑缺血再灌注大鼠侧枝循环形成影响的研究

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

全文总结

参考文献

攻读学位期间成果

致 谢

统计学审核证明