2型糖尿病患者外周血单个核细胞血红素加氧酶-1表达水平与氧化应激的相关性研究

摘要

[研究背景]： 随着社会的发展、生活方式的改变，糖尿病(diabetesmellitus，DM)的患病率在全球范围内快速增长，成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题[1]。据世界卫生组织估计，全球被诊断的DM人数将从2003年的1.94亿上升到2025年的3.33亿[2]。目前我国糖尿病患病率达到3％，并呈逐年增加趋势。DM对人们健康构成极大的威胁，对社会和经济带来极重的负担。 近年来，越来越多的证据表明，糖尿病及其慢性并发症的发生、发展与氧化应激密切相关。高糖诱导线粒体活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)生成增多[3]，ROS的强氧化能力使脂质发生过氧化、引起蛋白质变性、DNA断裂等，直接导致细胞损伤，并产生更多的ROS，形成恶性循环[4]。氧化应激的产生主要是机体氧化与抗氧化能力的失衡，机体的氧化状态与抗氧化状态都与糖尿病有密不可分的关系。 血红素加氧酶(hemeoxygenase，HO)在糖尿病抗氧化机制中的作用逐渐受到关注。HO在人体内发现已有几十年的历史，长期以来人们对HO的认识局限于它是一种催化血红素氧化降解、维持血红素代谢平衡的限速酶。近年来，越来越多的资料表明，HO及其代谢产物在多种疾病的病理生理过程中发挥作用。迄今为止，人类共发现三种HO的同工酶，分别是三种不同的基因编码产物，在分子量、氨基酸组成方面均存在较大差异[5]。HO-1是诱导型HO，HO-2和HO-3是结构型。HO-1在正常组织中表达甚微，多种刺激因素作用下可在全身组织细胞微粒体中表达，它是目前发现的受最多因素诱导的应激蛋白。刺激因素包括氧化应激、热休克、紫外线照射、缺血再灌注、重金属、细菌脂多糖、细胞因子、氧化型低密度脂蛋白及血流动力学改变等[6]。HO-1基因的诱导被认为是氧化应激的一种普遍标志。 HO-1及其代谢产物可通过降低组织细胞对氧化应激的敏感性等多种途径减少ROS的生成，从而保护细胞免受ROS攻击，减少细胞损伤和凋亡，发挥抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用。研究发现，在支气管哮喘、老年痴呆症患者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)中HO-1表达升高。对糖尿病患者的研究发现，HO-1表达增高可使胰岛细胞、内皮细胞和神经细胞等多种细胞免受氧化应激损伤[7-9]捌。目前对HO的临床研究领域涉及范围广泛，主要包括动脉粥样硬化、支气管哮喘、缺血再灌注损伤、移植物抗排斥反应等方面，而在糖尿病研究领域尚不深入且研究结论存在分歧。例如，在2型糖尿病的研究中发现：骨骼肌组织HO-1表达降低，单核细胞HO-1的表达增加，而视网膜中HO-1的表达增高或降低；关于2型糖尿病患者高血糖环境下，PBMC中HO-1的表达的改变情况目前研究国内甚少；由于糖尿病及慢性并发症病变范围广，可以累及全身大部分重要器官，其病变的广泛性和HO-1作用的广泛性也提醒和促进研究者对两者的关系进行深入研究，成为最近的研究热点。 本研究通过探讨糖耐量正常、糖耐量减低和初诊2型糖尿病这三种不同血糖水平个体PBMC的HO-1表达与氧化应激水平的关系，初步了解高糖诱导下的氧化应激对HO-1表达的影响，提示可望从干预HO-1表达的角度拮抗糖尿病氧化应激，为糖尿病及其并发症的防治提供新的思路。 本研究包括以下两部分： 第一章：2型糖尿病患者氧化应激及氧化损伤的研究 [目的]：了解NGT、IGT和T2DM患者PBMC的ROS产量及血清MDA水平，探讨不同血糖水平对氧化应激程度的影响。 [对象与方法]： 1、研究对象和分组：按1999年WHO糖尿病诊断和分型标准[10]将研究对象分为3组： ①糖尿病(DM)组：30例，男16例，女14例，均为2007年6月至2008年2月在南方医院内分泌代谢科首次确诊的2型糖尿病患者，FPG≥7.0mmol/L和(或)2hPG≥11.1mmol/L。 ②糖耐量减低(impairedglucosetolerance，IGT)组：30例，男15例，女15例，为同期确诊患者。FPG(6.1mmol/L和7.8mmol/L≤2hPG<11.1mmol/L。 ③正常糖耐量(normalglucosetolerance，NGT)组：30例，男15例，女15例。来自同期本院健康体检人群。FPG<6.1mmol/L和262G<7.8mmol/L。 所有研究对象除外下列疾病：急性心肌梗死，急、慢性心力衰竭，急、慢性心律失常，不稳定型心绞痛；脑梗塞，脑出血急性期；肝、肾功能不全；急、慢性感染，肿瘤，结缔组织病；糖尿病急性并发症。均不存在手术及其他应激情况。所有研究对象入院前均未使用过降糖、调脂及抗高血压药物。所有研究对象抽血前一个月内无使用维生素A、C、E，阿司匹林、皮质醇激素及其他抗氧化药物。正常对照组均无内分泌及代谢疾病，且除外糖尿病一级亲属。 2、各组研究对象禁食8～14h后次晨无菌操作抽取肘静脉血12ml。其中10ml装于EDTA抗凝真空采血管，立即行Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。2ml静脉血装于促凝真空采血管中，3000r/min离心，收集血清，-20℃保存。 3、利用荧光探针2，7-二氯氢化荧光素(2',7'-dichlorodihydrofluorescein，DCFH)，在488nm激发波长，525nm发射波长条件下，流式细胞仪检测各标本的平均荧光强度(meanfluorescenceintensity，MFI)，比较细胞内ROS的产量。硫代巴比妥酸比色法(TBA法)检测血清中MDA的含量：532nm波长，1cm光径条件下，使用可见光分光光度计测定各管的吸光度值。血清MDA含量=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×10。 4、实验数据经SPSS13.0统计软件进行统计分析。计算各组的均值和标准差(-x±s)，三组资料比较用多独立样本非参数检验(KIndependentSamplesTest)或单向方差分析(One-wayANOVA)，进一步多重比较用LSD法。检验标准为α=0.05。 [结论]： 1、与NGT组比较，IGT组、初诊2型糖尿病组PBMC中ROS产量逐渐增加，提示IGT阶段及初诊断的2型糖尿病患者处于较明显的氧化应激状态。 2、初诊2型糖尿病组较IGT组、NGT组血清中MDA含量显著升高。提示IGT阶段以及2型糖尿病患者初诊时已经出现了氧化应激损伤。 第二章：2型糖尿病患者外周血单个核细胞血红素加氧酶-1表达与氧化应激的相关性研究 [目的]：了解NGT、IGT和T2DM患者PBMC中HO-1的表达水平，探讨不同血糖水平PBMC中HO-1的表达与氧化应激的关系。通过抗氧化比值，了解机体抗氧化能力的变化。 [对象与方法]： 1、研究对象和分组：同第一部分。 2、各组研究对象禁食8～14h后次晨无菌操作抽取肘静脉血10ml装于EDTA抗凝真空采血管，立即行Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。取部分细胞涂片，行免疫荧光染色，剩余的细胞提取总RNA，行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，比较各组HO-1蛋白及mRNA的表达水平。 3、HO-1mRNA表达的测定：行RT-PCR反应，其中PCR扩增HO-1的上游引物序列5’-CTGGAGGAGGAGATTGAGCG-3’；下游引物序列5’-TAAGGACCCATCGGAGAAGC-3’。RT-PCR内参β-actin的上游引物序列5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’；下游引物序列5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。各组HO-1PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用Imagetool3.0图像分析软件分析基因表达值，基因表达值(％)=[各基因条带面积×(条带灰度-背景灰度)]÷[β-actin基因条带面积×(条带灰度-背景灰度)]×100。 4、HO-1蛋白表达的测定：将PBMC悬液涂于0.1％多聚赖氨酸载玻片上，免疫荧光染色后，封片在荧光显微镜下镜检，观察HO-1在细胞内的表达情况。在400倍镜下准确定位所测视野，使用Mias-2000高清晰度计算机病理图文报告系统，以每例标本表达量最强的5个高倍视野(×400)的积分光密度值作为该例的测定值，半定量分析HO-1的蛋白表达。 5、实验数据经SPSS13.0统计软件进行统计分析。计算各组的均值和标准差(-x±s)，三组资料比较用多独立样本非参数秩和检验(KIndependentSamplesTest)。相关分析采用多变量偏相关分析(PartialCorrelation)。检验标准为α=0.05。 [结论]： 1、与IGT组、NGT组比较，初诊的2型糖尿病患者HO-1的表达升高提示患者抗氧化系统活性的增强。 2、HO-1蛋白的表达水平与机体的氧化应激状态及氧化损伤程度存在正相关关系。 3、与NGT组比较，IGT组、初诊2型糖尿病组HO-1/MDA抗氧化比值降低，表明IGT和DM患者抗氧化能力减弱。提示高血糖抑制PBMC的抗氧化系统，可能是造成IGT和DM氧化应激的重要原因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略名词表

声明

前言

第一章2型糖尿病患者氧化应激及氧化损作的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

第二章2型糖尿病患者外周血单个核细胞血红素加氧酶-1表达水平及其与氧化应激的相关性研究

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

致谢

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