拉伸刺激对筋膜结缔组织重构及相关基因转录水平影响的研究

摘要

中国传统中医学作为中国几千年文化的结晶，在中华文明上下传承过程中起着举足轻重的作用，在国人防病治病特别是科技不发达时代的预防保健过程中不可或缺，是被实践证实了的历代中医文人志士的经验总结，为此深得大众推崇。近年来随着科技的发展、文化交流的加速和人民对绿色治疗手段的要求，在中医理论指导下开展的治疗手段不但在华人居住区而且在欧美发达地区如英国、德国、法国、比利时、荷兰、美国、加拿大广泛作为补充或替代治疗而开展。而作为传统中医学核心之一的经络学说或在其理论指导下的针灸实践，由于其手段的绿色性和机制的神秘性吸引国内外广大学者对它进行深入研究。回顾针灸经络研究历史，国外形成了二十世纪五六十年代和二十世纪末期至今的两段时期，而我国近来也投入大量资金和人力物力进行多学科综合性研究和攀登，历经五十多年三段研究高峰时期，设立“八五”和“九五”经络研究攀登计划，进行了临床、实验、机理方面的研究，证实了经络客观存在性、循经感传性、经穴.脏腑相关性，进一步发现经穴具有跨体节传导性，循经双向传递性、低阻高导性、高温发光性、钙离子富集性等特征。综观几十年经络探秘，各种假说纷至沓来，争议不断，难以趋同。最大的裂谷莫过于“功能”与“结构”、“整体”与“局部”之间的沟壑。经络研究历经风雨，逐渐形成神经生理学派.神经传导学说、生理生化学派-体液循环学说、生物物理学派-生物场学说，但这些学说各执一词，仅仅从一个侧面或角度证实了经络的存在但未曾囊括全部。近来自原林教授提出结缔组织在人体构成相互联系的“筋膜支架”和后来由H.M Langevin从针灸与皮下疏松结缔组织相互关系的角度提出1全身疏松结缔组织在人体构成“片状网络支架”和“信号网络”的观点后，研究人员逐渐认识到这一结构在人体的重要性，值得一提的是原林教授课题组在承担国家863计划“数字化虚拟中国人的数据集构建与海量数据库系统”项目的过程中，通过对人体结缔组织构成的筋膜支架进行标记和计算机三维重建之后得出筋膜在人体内从浅入深由5种结构构成：1.真皮致密结缔组织；2.皮下疏松结缔组织；3.肌肉表面疏松结缔组织；4.肌间隔和肌间隙结缔组织；5.内脏器官门、被膜和内部间隔结缔组织。课题组通过研究国标人体14条经络361个穴位的进针部位和手法，发现人体穴位的针刺部位均位于筋膜的不同层次，其中位于肌间隔和肌间隙结缔组织者最多，其次是真皮致密结缔组织层和皮下疏松结缔组织层，少数位于肌肉表面疏松结缔组织（深筋膜）和内脏器官门、被膜和内部间隔结缔组织。原林教授课题组通过上述研究并结合发育生物学，提出：中胚层间充质分化成多个器官系统后，所剩下的部分构成遍布全身的“筋膜支架”。该支架以细胞为主体，以纤维为框架，以胞外基质为主要成分建构了遍布全身相互沟通的空间“信息网络”，该系统在神经、体液、免疫的参与下为其他功能细胞的再生提供细胞储备和支持，同时检测和调控机体内环境的变化，也即“支持与储备系统”新观点。该观点认为皮下筋膜组织在机体对内在或外源性拉伸刺激的应答中起着重要的媒介作用并发挥调控作用，并以此推测各种替代疗法（supplement therapy，主要指在中国传统医学理论引导下开展的针灸、按摩等物理治疗措施，研究证实这些治疗手段主要是通过应力刺激下筋膜结缔组织形变而发挥生物学效应）作用靶点正是机体内的网状筋膜支架。该课题组在先期实验中利用超声、CT、MRI等医学影像手段和我国数字人海量数据集认为：在针刺的过程中，通过提插、捻转等操作，可以带动或牵动周边较大范围的结缔组织。一般当针灸针尖到达外肌膜时出现“得气”现象，当针尖到达肌肉处时志愿者的“得气”减弱，若针尖停留在外肌膜上再增加刺激，“得气”感会增强；并利用CT图像构建出与人体经典经络走行较一致的结缔组织筋膜支架且得到MRI图像证实；课题组在证实筋膜支架与经典经络线路一致性的同时也承认存在与经典径线走行不一致结构，对照中医关于穴位的记载：中医认为人体既有经穴也有阿是穴，经穴循经分布而阿是穴分布则没有固定位置，由此提出全身的结缔组织支架可能是针灸经络的解剖学物质基础；穴位是在结缔组织支架上在针刺进行提插和捻转时能够产生较强生物学信息的部位；穴位与非穴位仅仅有信息量的差异而没有质的区别；从广义的角度讲全身各个部位均是穴位，因为几乎所有人体的组织器官之间的间隙均有结缔组织存在。古代记载的穴位是人体结缔组织聚集处，刺激这些部位能通过自身的神经调节、体液调节等发挥疗效。 但课题组在前期的研究中多侧重从影像学或大体形态上证实筋膜网络支架的存在，而对筋膜结缔组织内纤维结构及对生命活动基本单位的细胞在力学刺激下如何反应，生命调节基本形式的基因调控是否参与到这一过程中来研究甚少，这也正是本研究讨论的问题。本研究借助免疫组织细胞化学及分子生物学方法从微观角度讨论拉伸刺激对筋膜结缔组织重构及相关基因转录水平影响，探讨经络的物质基础，并为筋膜学说提供理论支撑。 目的: 通过研究拉伸刺激对筋膜结缔组织重构及相关基因转录水平的影响，进一步为经络与结缔组织相关性提供证据支持，为筋膜学提供理论支撑，并探讨临床各种替代疗法的治疗机理。 1.通过对拉伸刺激下筋膜结缔组织纤维形态影响的研究，阐述胶原纤维或弹性纤维在拉伸刺激过程中作用。 2.通过对拉伸刺激下筋膜结缔组织内细胞形态影响的研究，讨论筋膜结缔组织内细胞在感受到拉伸应力后可能的生物学行为。 3.通过对拉伸刺激下筋膜结缔组织重构相关基因转录水平影响的研究，讨论拉伸刺激后可能的生物学意义。 方法: 1.借助中医针刺方法施加拉伸刺激，切取皮下疏松结缔组织并通过相差显微镜观察拉伸刺激对纤维走行的影响。 2.切取拉伸刺激后的皮下疏松结缔组织，通过鬼笔环肽/Pi染色，借助荧光显微镜观察拉伸刺激对筋膜结缔组织内细胞形态的影响。 3.通过RT-PCR方法，研究拉伸刺激对筋膜结缔组织重构相关基因转录水平的影响：CTGF、TGF-β1、Procollagen-1、Procollagen-3、MMP-2、MMP-3、TIMP-1、TIMP-2。 结果: 1.拉伸刺激后结缔组织内纤维排列方向与其受力方向一致，针刺捻转能带动一定范围内结缔组织发生位移。 2.纤维排列的改变及结缔组织位移引起结缔组织内细胞感受到力学刺激，细胞重构成长梭形，其长轴方向与细胞受力方向一致。 3.细胞在感受到拉伸刺激后，CTGF、TGF-β1、TIMP-1的转录水平下调（F值分别为4.774、6.151、15.877，P值分别为0.023、0.011、0.000）而Procollagen-1、Procollagen-3、MMP-2、MMP-3、TIMP-2无影响（F值分别为0.369、0.252、2.466、1.608、1.440，P值分别为0.695、0.779、0.115、0.219、0.265）。 结论： 1.通过针刺方法施加拉伸刺激，毫针捻转时胶原纤维或弹性纤维通过与毫针间静电作用而缠绕在针体上，拉伸刺激能带动周围纤维运动从而使结缔组织发生形变。对照组纤维保持其原有的无序排列。 2.拉伸刺激带动纤维形变，力学刺激信号通过纤维与细胞间粘着斑复合物等结构传导到细胞内，从而引起细胞骨架重构，细胞呈长梭形。 3.拉伸刺激对CTGF/TGF-β1/TIMP-1等基因转录水平的调控可能是替代疗法发挥治疗作用的机理之一。 总之，借助针刺捻转方法施加拉伸刺激，捻转时结缔组织内纤维通过与针体间静电耦合作用缠绕在针体周围，拉伸时直接带动结缔组织内纤维从而引起结缔组织形变，结缔组织形变的直接结果便是带动与纤维通过粘着斑复合物联系的细胞（主要是成纤维细胞，还有少数间充质干细胞等），从而拉伸刺激信号得以传递到细胞内，在胞内再通过细胞骨架重构以及一系列信号级联将外源性拉伸刺激信号传递到细胞核内，引起一系列变化，包括细胞增殖和对相关基因转录水平的调控。成纤维细胞作为结缔组织内主要细胞参与机体损伤与修复过程，同时还能合成多种细胞因子，包括基质形成或降解因子。而基质的形成或降解又直接影响到基底膜的通透性，这与多种疾病的发生发长有着密切的关系；而间充质干细胞作为一种多能干细胞则能向多方向分化，并能从数量上补充已经坏死或失去功能的细胞，参与损伤的修复重建；拉伸刺激传递到细胞核内后，引起一系列基因转录水平差异，如CTGF/TGF-β1/TIMP-I，这些基因证实也在组织的修复重建中发挥着重要作用，并调控着下游因子的转录活性，所以拉伸刺激引起筋膜结缔组织形变可能正是替代疗法的作用途径，而对细胞活性的影响或对基因转录水平的调控可能正是临床替代疗法的作用机理。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文对照缩略词表

声明

前 言

第一章 拉伸刺激对皮下疏松结缔组织纤维形态的影响

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二章 拉伸刺激对皮下疏松结缔组织细胞形态的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三章 拉伸刺激对皮下疏松结缔组织重构相关基因转录水平的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文小结

综述 细胞外基质代谢相关因子的研究进展

成果 攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加的学术会议

致谢

统计学证明