红曲拮抗高脂膳食诱导大鼠非酒精性脂肪肝分子机制研究

摘要

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，已经成为我国常见的慢性肝病之一，其发病率大约为14～20%，严重危害人民生活健康。NAFLD以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝及其演变的脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化。研究发现遗传易感性、胰岛素抵抗、肠源性内毒素血症以及PPARα与其发病关系密切。其中胰岛素抵抗是关键的始动因素，肠源性内毒素血症以及PPARα的表达下调作为“二次打击”，最终造成脂肪在肝脏大量蓄积出现脂肪肝的病理改变。 祖国医学虽无“脂肪肝”的病名，《内经》中有“肝满”、“肝胀”、“胁痛”等记载，符合脂肪肝的临床表现。其病位在肝，与胆、脾、胃、肾均有关。多因过食肥甘，或饮酒过度，或感受湿热疫毒，或情志失调，或久病体虚，导致痰湿瘀阻互结，痹阻肝脏脉络而成。红曲性味甘、温、无毒，归肝、脾胃、大肠经，具有健脾消食、活血化淤之功效；现代药理研究发现其有效成份之一的洛伐他汀，具有较为理想的抗炎、降胆固醇的功效，已在临床广泛利用。因此，本课题组推测，红曲可能具有较好的抗NAFLD的效应，对红曲抗NAFLD的分子机制深入研究，是中药创新的切入点。 本项目在中医药理论指导下，结合现代医学研究进展，通过高脂饮食诱导胰岛素抵抗NAFLD大鼠模型，继而予以不同剂量红曲干预8周，以绞股蓝为阳性对照组，采用HE染色、全自动生化分析、胰岛素-血糖钳夹、RT-PCR、Western-blot、ELISA等实验技术检测各组大鼠血脂、肝脏生化、胰岛素抵抗以及TNF-α、IL-6、IL-10、PPARα等指标的变化，探讨红曲治疗NAFLD的效应及其作用机制，为提高中医药防治水平提供实验依据。 目的： 观察红曲对胰岛素抵抗，肝脏生化、血脂改变以及TNF-α、IL-6、IL-10、PPARα等指标的影响，探讨胰岛素抵抗、肠源性内毒素血症以及过氧化物增殖激活受体在大鼠NAFLD发病中的作用及红曲拮抗NAFLD的分子机制。 方法： 48只SD大鼠，雌雄各半，适应性喂养1周后，按体重随机分为6组，正常组、模型组、绞股蓝组、红曲低剂量组、红曲中剂量组、红曲高剂量组，每组8只。正常组予普通饲料，同步饲养8周；其余各组予高脂饲养喂养，并分别予等剂量生理盐水、绞股蓝水溶液、低、中、高剂量红曲水溶液灌胃，连续8周。第9周，处死所有大鼠，取肝脏及腹主动脉血备用。 HE染色、光镜下对各组大鼠肝脏组织病理学评分，从形态学上分析NAFLD大鼠及红曲干预后肝脏组织结构的变化；全自动生化分析仪分析血清ALT、AST、及血脂变化；放免法检测肝纤四项；正常葡萄糖-高胰岛素钳夹技术评估胰岛素抵抗变化，以观察红曲改善胰岛素抵抗的效应；ELSIA及RT-PCR技术检测各组大鼠TNF-α、IL-6、IL-10水平变化，分析红曲对TNF-α、IL-6、IL-10的影响，以观察红曲对上述细胞因子的调控机制；Western-blot、RT-PCR技术检测各组大鼠肝脏PPARα mRNA和蛋白水平变化，从蛋白表达水平和从基因转录水平分析NAFLD大鼠肝脏PPARα的情况及红曲对其进行治疗后的肝脏PPARα的影响。 统计学处理：计量资料用平均值±标准差（x±s）表示，数据处理采用SPSS11.5统计软件包进行单因素方差分析（One-way ANOVA）；计数资料采用秩和检验。P<0.05有统计学意义。 结果： 1.红曲对NAFLD大鼠的症状、体征的影响 2.红曲对NAFLD大鼠肝组织形态学的影响 3.红曲对NAFLD大鼠肝功能、血脂的影响 4.红曲对NAFLD大鼠肝纤维化的影响 5.红曲对NAFLD大鼠胰岛素抵抗的影响 6.红曲对NAFLD大鼠肠源性内毒素血症的影响 7.红曲对NAFLD大鼠肝脏PPARα的影响 结论： 1连续8周高脂饮食成功建立了大鼠脂肪肝胰岛素抵抗模型。该模型的病理特征为肝细胞呈大泡性脂肪变性，伴小叶内炎症细胞浸润、一定程度的肝纤维化和线粒体结构的异常；代谢特征为胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高脂血症、和血清转氨酶升高。该模型与人类肥胖所致NAFLD的病理和代谢改变极其相似，造模简单、模型成功率高，为研究NAFLD的发病机制，筛选有效的防治药物提供了良好的工具。 2红曲能有效的拮抗大鼠NAFLD的进程，其作用机制为： ①红曲能够改善NAFLD模型大鼠的一般情况：如改善大鼠模型的精神状况、耗食量、以及营养状况。 ②肝脏病理学观察表明红曲能改善肝脏脂肪变性，减少肝细胞坏死以及炎性细胞浸润。 ③红曲降低NAFLD模型大鼠血清ALT、AST含量，但无明显降低血甘油三脂的效应。提示红曲能有效减轻炎症反应，保护肝细胞，减轻脂肪性肝炎改变。 ④红曲降低NAFLD模型大鼠胰岛素抵抗及高胰岛素血症，增加胰岛素敏感性，从而阻断“初次打击”。 ⑤红曲降低NAFLD模型大鼠组织中TNF-α的表达，改善肠原性内毒素血症，从而抑制选择性胰岛素抵抗，阻断“二次打击”，抑制脂肪肝的发生。 ⑥红曲能升高NAFLD模型大鼠PPARα的mRNA及其蛋白质的表达，促进脂肪β氧化，减少脂肪肝毒性损害，发挥缓解脂肪肝的效应。 综上所述，红曲可能通过改善胰岛素抵抗，抑制促炎因子TNF-α表达，发挥抗炎效应；诱导肝细胞PPARα的mRNA和蛋白水平增加，维持体内脂质代谢的动态平衡，发挥多环节、多靶点拮抗NAFLD的药理效应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

声明

第一部分文献研究

1中医学对脂肪肝的认识

2过氧化物酶体增殖物激活受体结构功能

3胰岛素抵抗与NAFLD

4论文的研究意义和主要内容

5展望

第二部分高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗NAFLD模型的建立

1材料和方法

2结果

3讨论

第三部分胰岛素抵抗在NAFLD的发病地位及红曲干预作用

1材料与方法

2结果

3讨论

第四部分红曲对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肠源性内毒素血症影响

1材料与方法

2结果

3讨论

第五部分红曲对非酒精性脂肪性肝炎大鼠PPARa影响的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

第六部分 讨论

一、中医对脂肪及脂肪肝的认识

二、炎症相关细胞因子与胰岛素抵抗及脂肪肝病理机制

三、中药红曲对非酒精性脂肪肝疗效及其作用机制

四、问题与展望

参考文献

全文小结

综述 研究脂肪酸结合蛋白在防治脂肪肝中的作用

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明