慢性上气道阻塞性疾病肌肉组织学特性的实验性研究

摘要

慢性上气道阻塞性疾病有两种代表性疾病：睡眠呼吸疾病（sleep-related breathing disorde）与声带麻痹（paralysis of vocal cord）导致的上气道阻塞性疾病。这两种疾病在耳鼻喉头颈外科领域是非常常见的。 睡眠呼吸疾病是一种有着很高的发病率的疾病，它严重影响生活质量、危害身体健康。睡眠呼吸疾病中一种重要的疾病是阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS或OSAS），阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）是指睡眠时上气道反复发生塌陷、阻塞引起的睡眠时呼吸暂停和通气不足，伴有打鼾，睡眠结构紊乱，频繁发生血氧饱和度下降，白天嗜睡等病症。它可发生于任何年龄。但以中年肥胖男性发病率最高。OSAS不仅作为多种心脑血管疾病、内分泌系统疾病及咽喉部疾病的源头性疾病，而且提高了车祸的发生率，降低了人的生活质量。近十年来它受到越来越多的重视，在美国大样本流行病学调查发现，睡眠呼吸紊乱的发病率在中年人群中达2-4％（女性约2％、男性约4％）。在日本发病率略高于美国。虽然中国目前还没有准确的数字，但严重程度不容乐观。 声带麻痹导致上气道阻塞性疾病常常引发呼吸困难、危及生命，一直以来都没有很好的解决办法，且发病率不低。其中美国每年双侧喉返神经麻痹发生2000例左右。我国目前没有较为详细的流行病资料，但研究者在临床工作中遇到的病例有逐年增加的趋势。多见于甲状腺、喉、食道、颅底以及心脏主动脉手术，医源性的声带麻痹的数量正在不断地增加。 这两种上呼吸道阻塞性疾病均有骨骼肌参与。有上气道肌功能障碍导致的OSAS，有环杓后肌功能障碍导致的声带麻痹。 睡眠呼吸暂停综合征主要的一个病因就是上气道扩张肌张力下降，而软腭肌是上气道肌肉中重要的一种肌肉。声带麻痹是因为损伤喉返神经导致环杓后肌麻痹，声门不能开大，患者出现呼吸困难而来就医的。软腭肌及环杓后肌这些肌肉组织学特性的研究对了解疾病的发病机制非常有利并为今后的治疗提供参考。本研究包括以下两部分： 第一章、睡眠呼吸暂停综合征相关肌肉组织学特性的实验性研究。 目的： 1.研究与睡眠呼吸暂停综合征相关的软腭肌肉与正常软腭肌肉相比各种类型肌纤维及胶原纤维mRNA表达量的不同。2.研究与睡眠呼吸暂停综合征相关的软腭肌肉与正常软腭肌肉相比在病理形态学上的变化。 对象与方法： 1.材料标本的获取：以多导睡眠监测（PSG）为诊断OSAS的金标准，诊断为OSAS的病人提取的软腭肌肉标本为实验组，诊断为非OSAS的病人提取的软腭肌肉标本为正常对照组。20例病人，男15例，女5例。实验组每组12人，年龄39.67±7.68岁，正常对照组8人，年龄29.13±8.36岁。所有病人总的年龄35.45±9.38岁，总的体重指数24.35±4.18kg/㎡，（mean±s.d.）。 2.利用实时定量PCR-（Realtime-PCR）方法检测软腭肌各种类型肌纤维及胶原纤维mRNA表达量的不同。包括以下两个步骤：（1）RNA的分离及cDNA的获得（2）实时定量PCR方法分析各型肌纤维及胶原纤维mRNA表达量的不同。 3.利用肌肉ATPase染色技术在PH4.6下分清软腭肌三种肌纤维类型Ⅰ型、ⅡA型与ⅡX型，在PH4.3下分清Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维，计算实验组与对照组单位面积下各型肌纤维的数目，进行比较。 4.实验数据经SPSS13.0统计软件进行统计分析。计算各组的均值和标准差（x±s），两组资料比较用独立样本t检验（Independent Samples T Test）。检验标准为α=0.05。使用pearson相关分析检验年龄和体重指数（BMI）与胶原纤维、肌纤维mRNA表达和ATP酶染色肌纤维数目有无相关性，检验标准为α=0.05。 结果： 1.（1）实时定量PCR（Real-time PCR）方法检测正常对照组及实验组软腭肌纤维亚类型及肌肉中胶原纤维的mRNA表达，只有实验组ⅡX型肌纤维mRNA表达增多有统计学差异，t=-2.926，p=0.009（p<0.01）。（2）测试了主要的3种亚型软腭肌肌纤维mRNA表达值相互之间比例值的变化。它们分别是：1.Ⅰ/ⅡA2.Ⅰ/ⅡX3. ⅡA/ⅡX。三种比例值变化组间均无统计学差异。 2.研究发现在PH4.3下实验组和正常对照组的Ⅰ型肌纤维数目有统计学差异，t=-2.668，p=0.029（p<0.05）。Ⅰ型肌纤维在PH4.3染色条件下实验组数目低于正常对照组。在PH4.6下实验组和正常对照组的各型肌纤维数目无统计学差异。 3.使用pearson相关分析得出年龄和体重指数（BMI）与胶原纤维、肌纤维mRNA表达和ATP酶染色肌纤维数目无相关性。 结论： 1、与正常对照组相比较，实验组ⅡX型肌纤维mRNA表达明显增多，收缩速度快，收缩力较强的ⅡX型肌纤维mRNA明显增多，说明睡眠呼吸暂停综合征患者软腭ⅡX型肌纤维数目可能增加，肌肉收缩力度部分增强。 2、Ⅰ型肌纤维在PH4.3染色条件下实验组数目低于对照组。说明睡眠呼吸暂停综合征患者软腭肌Ⅰ型肌纤维数目可能减少，说明肌肉收缩力较正常对照组要强，但收缩持续时间可能要缩短。 第二章、声带麻痹相关肌肉组织学特性的实验性研究。 目的： 1.研究与去喉返神经支配的环杓后肌与正常肌肉相比各种类型肌纤维及胶原纤维mRNA表达量的不同。 2.研究去喉返神经支配的环杓后肌与正常肌肉相比在病理形态学上的变化。 对象与方法： 1.材料标本的获取：成年大鼠购于广东省人民医院实验动物中心，总共16只。随机分为实验组和正常对照组。实验组8只老鼠手术切断一侧喉返神经，缝合切口，饲养40天。正常对照组8只老鼠同一时间从实验组相同皮肤切口处切开皮肤，游离出喉返神经后，不切断喉返神经，缝合切口，饲养40天。术前麻醉药剂量为（氯胺酮0.15ml/100g，安定0.15ml/100g）。40天后，手术取实验组喉返神经切断侧的环杓后肌与正常对照组相同侧的环杓后肌肌肉标本，供提取RNA用。剩余相同侧的环杓后肌投入-170度的液氮中保存，供ATP酶染色使用。 2.利用实时定量PCR（Realtime-PCR）方法检测环杓后肌各种类型肌纤维及胶原纤维mRNA表达量的不同。包括以下两个步骤：（1）RNA的分离及cDNA的获得。（2）实时定量PCR方法分析各型肌纤维及胶原纤维mRNA表达量的不同。 3.利用肌肉ATP酶染色技术在PH4.6下分清三种肌纤维类型Ⅰ型、ⅡA型与ⅡB型，在PH4.3下分清Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维，计算实验组与对照组单位面积下各型肌纤维的数目，进行比较。 4.实验数据经SPSS13.0统计软件进行统计分析。计算各组的均值和标准差（x±s），两组资料比较用独立样本t检验（Independent Samples T Test）。检验标准为α=0.05。 结果： 1.实时定量PCR（Real-time PCR）方法检测正常对照组及实验组环杓后肌纤维亚类型及肌肉中胶原纤维的mRNA表达，只有实验组Eo型肌纤维mRNA表达减少组间有统计学差异，t=3.046，p=0.009（p<0.01）。2.测试了主要的4种亚型大鼠环杓后肌肌纤维mRNA表达值相互之间比例的变化。它们之间的六种比例值变化分别是：1.Ⅰ/ⅡA2.Ⅰ/ⅡB3.Ⅰ/ⅡX4.ⅡA/ⅡB5.ⅡA/ⅡX6.ⅡB/ⅡX。其中只有Ⅰ/ⅡB比例值实验组减少有统计学差异，t=2.679，p=0.018（p<0.05）。 2.因大鼠环杓喉肌较小，去神经后环杓后肌肌肉严重萎缩，ATP酶染色肌纤维数目太少，在显微镜下，环杓后肌的总数量和总体积明显减少。 结论： 1.与正常对照组相比较，实验组Eo型肌纤维mRNA表达减少有统计学差异，收缩速度最快，收缩力较强的Eo型肌纤维mRNA减少，说明声带麻痹40天Eo型肌纤维数目可能减少，肌肉收缩力度部分减弱。 2.Ⅰ/ⅡB型mRNA表达量实验组比例值显著减少说明在声带麻痹40天左右，收缩力较大的ⅡB型肌纤维mRNA表达量相对收缩力较小的肌肉Ⅰ型纤维有增加的趋势，而收缩力较小的肌肉Ⅰ型纤维mRNA表达量相对收缩力较大的ⅡB型肌纤维有减少的趋势。提示去神经支配的环杓后肌的收缩力可能会有一定程度的增强。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词对照表

声明

前言

第一章睡眠呼吸暂停综合征相关肌肉组织学特性的实验性研究

1材料与方法

2.结果

3.讨论

第二章声带麻痹相关肌肉组织学特性的实验性研究

1材料与方法

2.结果

3.讨论

全文小结

参考文献

致谢