减毒沙门菌介导mtHSP70/HSV-tk双基因真核共表达DNA疫苗靶向抗肿瘤实验研究

摘要

本研究综合了目前国内外肿瘤疫苗设计的各自优势,将基因治疗、免疫治疗结合起来,设计了一种全新的广义上的基因疫苗,即构建以结核杆菌热休克蛋白70和人单纯疱疹病毒一胸苷激酶基因为基础的双基因真核共表达DNA疫苗,利用减毒沙门菌对肿痛的靶向性以之为载体,瘤内注射治疗实体黑色素瘤,其学术思想是以减毒沙门菌将mtHSP70/HSV-TK基因疫苗靶向传递至肿瘤细胞,予以HSV-TK前体药物更昔洛韦(Gancivol,GCV),启动HSV-TK对肿瘤细胞的杀伤作用及旁观者杀瘤效应,死亡的肿瘤细胞与mtHSP70形成mtHSP70肽复合物,该复合物带有全肿瘤细胞抗原的指纹且mtHSP70为异种,其抗原性优于目前国内外DNA疫苗设计常用的以肿瘤某一特定抗原所构成的基因疫苗,利于打破目前存在的因DNA疫苗免疫原性不强形成的免疫耐受,达到抗肿瘤效应。
　　 [目的]:
　　 ①构建结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)和自杀基因单纯疱疹病毒一胸苷激酶(HSV-tk)双基因真核共表达质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK及实验对照组质粒PCMV-TK-IRES-EGFP和PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP。
　　 ②研究重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK与对照组质粒pCMV-TK-IRES-EGFP、pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP、PCMV-IRES-EGFP的体外表达及体外抗小鼠黑色素瘤细胞B16的效应。
　　 ③构建SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK重组沙门菌及对照组SL7207/pCMV-TK-IRES-EGFP、SL7207/pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP、SL7207/pCMV-IRES-EGFP重组沙门菌及研究重组沙门菌体外的表达和对B16细胞的侵袭性。
　　 ④确定重组沙门菌瘤内注射的剂量、时效性及治疗方案；研究重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK瘤内注射抗小鼠B16肿瘤效应及机制。
　　 [方法]:
　　 ①登陆genbank查询HSV-TK和mtHSP70基因mRNA序列,应用引物设计软件DNAclub分别设计扩增HSV-TK和mtHSP70基因全长cDNA的特异引物。
　　 ②24孔培养板传代培养细胞融合至50～70％时,依照Lipofectamine2000转染试剂盒操作说明进行转染,培养箱中继续培养24～48h,荧光显微镜下观察转染效率。
　　 ③制备沙门菌株SL7207感受态,分别将质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK,PCMV-IRES-EGFP,PCMV-mtHSP70-IRES-EGFP,PCMV-TK-IRES-EGFP电转入沙门菌SL7207,构建相应的重组沙门菌并酶切鉴定,将通过酶切鉴定的四个重组沙门菌分别接种于LB固体培养基反复传代培养20代后,抽提质粒,再行酶切鉴定减毒沙门菌SL7207携带质粒的稳定性。
　　 ④以细胞浓度为107/ml的小鼠黑色素瘤B16细胞0.1ml接种于C57BL/6J小鼠右背皮下建立小鼠黑色素肿瘤模型。
　　 [结果]:
　　 ①构建的pCMV-mtHSP70-IRES-TK质粒分别用NotⅠ单酶切及EcoRⅠXhoⅠ双酶切进行酶切鉴定,酶切产物电泳见特异酶切图谱,确定为重组质粒pCMV-mtHSP70-IRES-TK；构建的pCMV-TK-IRES-EGFP以SalⅠ和BamHⅠ酶切见特异酶切图谱,确定为重组质粒pCMV-TK-IRES-EGFP。构建的pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP以XhoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实为mtHSP70重组质粒pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP。
　　 ②含EGFP的重组质粒转染到B16细胞中,48h后荧光显著增强了,细胞表达绿色荧光率约70％,细胞荧光分布于整个细胞。
　　 ③各重组沙门菌中抽提质粒,分别按相应的酶切体系进行酶切鉴定,酶切产物电泳均见特异酶切图谱,表明重组沙门菌构建成功。将通过酶切鉴定的四个重组沙门菌分别接种于LB固体培养基反复传代培养20代后抽提质粒,分别按相应的酶切体系进行酶切鉴定,结果与预期的一致,表明重组沙门菌携带质粒具备稳定性。重组菌感染B16细胞后,光镜下观察到B16细胞胞体变圆,荧光显微镜下观察到感染后36小时含EGFP的重组菌表达强的绿色荧光蛋白,表达率约为95％。电镜下观察均可见多个重组菌侵入B16肿瘤细胞的胞浆内,B16细胞发生肿胀。westernblot检测到各重组菌感染B16细胞后在B16细胞中分别表达相关目的基因的蛋白。
　　 ④选择109CFU/ml的重组沙门菌为治疗剂量。将瘤内注射重组菌的小鼠分别于注射后第二天,第四天,第七天各处死三只小鼠,取瘤,制作冰冻切片,荧光显微镜下观察作为报告基因的EGFP的表达,结果显示瘤内注射后第二天的肿瘤组织内可见作为报告基因的EGFP的表达,第四天的肿瘤组织内EGFP表达明显增强,第七的肿瘤组织内仍可见EGFP表达,但强度有所减弱。重组沙门氏菌瘤内注射后,电镜下观察到大量的重组菌侵入肿瘤细胞内,位于肿瘤细胞的胞浆内,细菌可在肿瘤细胞胞浆内进行有丝分裂增殖,肿瘤细胞发生细胞溶解,HT组及T组均可见肿瘤细胞出现细胞核固缩,核边集的细胞凋亡现象和内质网肿胀、细胞溶解坏死、微血管断裂；H组和Sa组可见内质网肿胀、细胞溶解坏死及凋亡；PBS组电镜下未见肿瘤细胞明显的改变,黑色素颗粒明显,肿瘤细胞器完整。我们对重组疫苗治疗后做了安全性评估,以109CFU/ml的重组沙门菌行瘤内注射100ul后,小鼠的生存状态良好,无腹泻,肿瘤局部无脓肿坏死,治疗期间体重无明显改变,取经重组菌治疗后荷瘤小鼠肝、肾、肺、胃、脾HE切片检查,均未见明显病理改变。
　　 [结论]:
　　 ①本实验通过酶切鉴定,成功构建重组质粒pCMV-mtHSP70-IRES-TK、pCMV-TK-IRES-EGFP、pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP。
　　 ②重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK、pCMV-TK-IRES-EGFP、pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP能在体外B16细胞中正确表达目的基因及含TK基因的质粒体外在GCV的作用下具有抗小鼠黑色素瘤细胞B16的效应。
　　 ③重组沙门菌构建成功,减毒沙门菌携带质粒具有稳定性,对小鼠黑色素B16肿痛细胞具有侵袭性并能在B16细胞中表达目的基因的蛋白。
　　 ④动物实验结果表明以减毒沙门菌携带的mtHSP70/HSV-tk双基因真核共表达重组DNA疫苗瘤内注射对B16肿瘤细胞具有靶向性且能引起强烈的细胞毒性T细胞反应,能显著抑制肿瘤的生长。该策略安全有效。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献回顾优化肿瘤DNA疫苗策略的研究进展

参考文献

第二章 mtHSP70和HSV-tk双基因真核共表达质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK的构建

第一节 pCMV-mtHSP70-IRES-TK重组质粒的构建

第二节 pCMV-TK-IRES-EGFP质粒的构建

第三节 pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP质粒的构建

第四节 讨论

参考文献

第三章 重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK体外表达及抗小鼠黑色素瘤细胞B16的效应

第一节 重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK体外表达

第二节 重组质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK体外抗小鼠黑色素瘤细胞B16的效应

第三节 讨论

参考文献

第四章 重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK的构建与表达

第一节 重组沙门菌的构建及稳定性

第二节 重组沙门菌在B16细胞中表达目的基因及对B16细胞的侵袭性73

第三节 讨论

参考文献

第五章 重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK瘤内注射抗小鼠B16肿瘤实验

第一节 重组沙门菌瘤内注射的剂量、时效性及治疗方案的确定

第二节 重组沙门菌瘤内注射抗小鼠B16肿瘤

第三节 讨论

参考文献

全文总结

附录1 缩略语表

附录2 测序结果

附录3 克隆基因同源性比较

附录4 质粒图谱

附录5 专利申请受理通知书

附录6 统计学审稿证明

攻博期间发表论文及科研立项

致谢