γ-氨基丁酸对人卵巢颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌及凋亡的影响

摘要

γ-氨基丁酸（γ-gamma-aminobutyric acid，GABA）由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下脱羧而成，是中枢抑制性神经递质。近年来人们发现30多种外周组织中有GABA存在，特别是卵巢和输卵管中含量最高，提示GABA可能对生殖系统有某种生理作用。进一步研究发现，大鼠卵巢中有GABA能神经元，卵巢组织上有GABA的特异性结合位点。动物实验提示外源性GABA对黄素化颗粒细胞分泌雌二醇（Estradiol，E2）和孕酮（Progesterone，P）有抑制作用，并且这种抑制作用可能与GABA受体及腺苷酸环化酶系统有关。有资料表明GABA可促进体外培养的大鼠黄体颗粒细胞自发凋亡。国内外许多学者报道IVF-ET中颗粒细胞凋亡增加影响妊娠的结局。本实验利用电化学发光法探索外源性GABA影响人卵巢黄素化颗粒细胞分泌雌二醇及孕酮的可能机制，并且通过TUNNEL法检测外源性GABA对人黄素化颗粒细胞凋亡的影响，并利用ELISA法测定GABA浓度，探索外源性GABA对IVF-ET妊娠结局的影响。 第一部分 GABA对人卵巢颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的影响 文献已证实外源性GABA对大鼠卵巢黄素化颗粒细胞分泌E2和P有抑制作用，并且可能与GABA受体及腺苷酸环化酶系统有关。但外源性GABA是否对人卵巢黄素化颗粒细胞分泌E2和P也有抑制作用，尚未有人做过这样的报道。 [研究目的] 本实验采用电化学发光法（electrochemiluminescence ECL）探索外源性GABA对人卵巢巢黄素化颗粒细胞分泌E2和P的可能作用机制。 [材料和方法] 1.标本来源来自2008.12-2009.1于南方医院生殖中心行IVF/ICSI-ET的患者32例，且为首个IVF/ICSI-ET治疗周期，年龄均小于35岁，不孕原因均为输卵管因素不孕或男性因素不孕，均采用长周期降调节方案。在取卵日获取患者卵泡液，离心分离黄素化颗粒细胞，将分离出的黄素化颗粒细胞分为4组进行体外培养24小时，换液，换为无血清培养基，加入处理因子，使培养液的终体积为1ml，GABA浓度为4×10-6mol/L，GABA阻断剂荷包牡丹碱（Bicuculine）浓度为1×10-6mol/L，腺苷酸环化酶激动剂（Forskolin）浓度为1x10-3 mol/L，人绒毛膜促性腺激素（hCG）浓度为0.1IU/ml，继续培养24小时留取上清液液待测。 2.分组; （1）加入GABA（4×10-6mol/L），观察GABA对人卵巢黄体化颗粒细胞雌二醇及孕酮分泌的影响（n=8），分为2组：对照组；GABA组。 （2）加入GABA阻断剂荷包牡丹碱（Bicuculine，1×10-6mol/L），观察GABA对Bicuculine诱导的人卵巢黄体化颗粒细胞雌二醇及孕酮分泌的影响（n=8），分为4组：对照组；GABA组；Bicuculine；GABA+Bicuculine。 （3）.加入腺苷酸环化酶激动剂（Forskolin，1×10-3mol/L），观察GABA对Forskolin诱导的人卵巢黄体化颗粒细胞雌二醇及孕酮分泌的影响（n=8），分为4组：对照组；GABA组；Forskol in：GABA+Forskolin。 （4）加入人绒毛膜促性腺激素（hCG，0.1IU/ml），观察GABA对hCG诱导的人卵巢黄体化颗粒细胞雌二醇及孕酮分泌的影响（n=8），分为4组：对照组；GABA组：hCG；GABA+hCG。 3.统计学方法人雌二醇和孕酮测定采用电化学发光法试剂盒检测上清液中E2和P浓度，比较各组中激素浓度的变化。利用SPSS13.0软件进行统计学处理，采用独立样本t检验比较对照组与GABA组之间激素水平的差异；采用析因方差分析比较各处理组与对照组之间激素水平的差异，独立样本t检验进行两两比较。P<0.05差异有统计学意义。 [结果] 1.加入4×10-6mol/L的GABA抑制人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌； 2.1×10-6mol/L的GABA受体阻断剂荷包牡丹碱（Bicuculine）能促进人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌，并且GABA能抑制Bicuculine诱导的人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌； 3.1×10-3mol/L的腺苷酸环化酶激动剂（Forskolin）能促进人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌，并且GABA能抑制Forskolin诱导的人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌； 4.0.1IU/ml的人绒毛膜促性腺激素（hCG）能促进人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌，并且GABA能抑制hCG诱导的人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌。 [小结] 本实验提示： 1.加入4×10-6mol/L的GABA抑制人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌； 2.GABA影响人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌可能通过颗粒细胞膜上的GABA受体介导； 3.GABA影响人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌与腺苷酸环化酶系统有关； 4.GABA和HCG相应受体相互作用时可能相互影响。 第二部分 GABA对颗粒细胞凋亡的影响。 许多研究报道卵巢中体细胞和生殖细胞的凋亡均与卵泡闭锁有关，而对卵巢体细胞凋亡的研究又主要集中于颗粒细胞。 [研究目的] 本实验研究在IVF周期中，妊娠组与非妊娠组卵泡液中GABA的浓度及外源性GABA对人卵巢黄体化颗粒细胞凋亡的影响。 [材料和方法] 1.标本来源来自2008.12-2009.1于南方医院生殖中心行IVF/ICSI-ET的患者40例，且为首个IVF/ICSI-ET治疗周期，年龄均小于35岁，不孕原因均为输卵管因素不孕或男性因素不孕，均采用长周期降调节方案。①颗粒细胞的收集：在取卵日获取患者的卵泡液，离心分离黄素化颗粒细胞，将分离出的黄素化颗粒细胞分为2组进行体外培养24小时，换液，换为无血清培养基，实验组即GABA组加入GABA，使培养液的终体积为1ml，GABA浓度为4×10-6mol/L，继续培养24小时，去掉上清液，收集贴壁细胞涂片。②卵泡液的收集：取卵日留取成熟卵泡（≥15mm）的穿刺液，离心，取上清装入EP管待测卵泡液中的GABA浓度。 2.分组; 1）分为妊娠组（17例）和非妊娠组（23例）分别测定两组病人成熟卵泡液中的GABA浓度，比较差异。 2）分为对照组和GABA组，比较凋亡率。（n=10） 3.统计学方法利用人γ-氨基丁酸ELISA试剂盒检测卵泡液中GABA浓度，比较两组卵泡液中GABA浓度，TUNNEL法测凋亡率，用SPSS13.0软件进行统计学处理，独立样本t检验比较两组浓度的差异及两组凋亡率的差异，P<0.05差异有统计学意义。 [结果] 1.妊娠组GABA的浓度明显低于非妊娠组的浓度（680.398±11.279 vs713.832±9.517）ng/ml，并且差异有统计学意义（P<0.05）。 2.对照组和GABA组人黄体化颗粒细胞凋亡百分数分别为（20.08±2.44 vs29.27±2.02）％，GABA组凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。 [小结] 1.本实验测定出人卵泡液中GABA的浓度在非妊娠组组高于妊娠组，差异有统计学意义。 2.本实验在人卵巢体外培养的黄体化颗粒细胞中加入GABA，发现GABA可使培养的黄体化颗粒细胞凋亡的百分数增高，差异有统计学意义。 全文小结 1.本实验采用电化学发光法试剂盒检测E2和P浓度，观察γ-氨基丁酸（GABA）对人黄体化颗粒细胞E2和P分泌的影响，并且探讨GABA影响人黄体化颗粒细胞E2和P分泌的可能作用机制。结果提示：①加入4×10-5mol/L的GABA抑制人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌；②GABA影响人卵巢黄体化颗粒细胞E2和P的分泌可能通过颗粒细胞膜上的GABA受体介导；与腺苷酸环化酶系统有关；GABA和HCG相应受体相互作用时可能相互影响。 2.运用免疫荧光法（ELISA）研究在IVF周期中妊娠组与非妊娠组颗粒细胞中GABA的浓度，结果表明非妊娠组的GABA浓度显著高于妊娠组；并且通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNNEL）检测GABA对人黄素化颗粒细胞凋亡的影响，结果表明加入4×10-6mol/L的GABA后可使培养的黄体化颗粒细胞细胞凋亡百分数增高。本实验提示：高浓度的GABA，可能增加颗粒细胞的凋亡率，从而影响卵母细胞的质量，而降低妊娠率。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分GABA对不同因素作用下的人黄体化颗粒细胞E2,P分泌的影响

材料

方法

结果

讨论

小结

第二部分GABA对颗粒细胞凋亡的影响

材料

方法

结果

讨论

小结

全文小结

参考文献

综述：γ-氨基丁酸在生殖领域的研究现状

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明