重组肿瘤相关抗原的表达及检测其血清自身抗体诊断肺癌的研究

摘要

本研究尝试应用麦胚连续交换无细胞快速蛋白质翻译系统（RTS Wheat Germ CECF），该系统是真核翻译，表达出来的蛋白质在翻译后修饰方面远较原核表达复杂，更加接近人体的情况。利用这些蛋白检测血清自身抗体有可能提高诊断肺癌的敏感性和特异性。国内外目前还没有关于基于医学文献证据的TAAs基因在RTS Wheat Germ CECF表达出可溶性蛋白检测血清自身抗体以诊断肺癌的报告。 研究目的: 本研究旨在探索基于TAAs基因的初步医学证据，扩大需要的TAAs数量，利用RTS Wheat Germ CECF表达TAAs基因，提高TAAs的质量；利用RTS Wheat Germ CECF表达成功的多个TAAs检测初治肺癌患者血清，分析相应的血清自身抗体单独或联合应用对肺癌的诊断价值。 研究方法: 1．在PubMed（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/）检索已公开发表、对肺癌具有初步诊断价值的肿瘤相关抗原（TAAs）文献，可根据蛋白查到其相应的编码基因；然后登录到GenBank（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/）获取本研究选取的基因的编码序列。 2．提取10个人体组织的总RNA，进行逆转录反应，从中扩增出入选的人类TAAs编码基因。 3．构建入选基因的无细胞表达克隆，在RTS Wheat Germ CECF表达入选基因。 4．精选在RTS Wheat Germ CECF表达成功的可溶性纯化蛋白，采用ELISA间接法，检测初治肺癌患者、良性疾病患者和健康者的血清，得到各自身抗体在这三类受试者的光密度值（OD值）。 5．以“健康者平均OD值+3×标准差”或“健康者平均OD值+2×标准差”作为截断值（cutoff value）计算各自身抗体的阳性率、5个参数（敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值）和吻合系数κ，描绘ROC曲线及算出AUC。 6．比较两种截断值下各抗体诊断指标的变化。 7．统计学方法：独立样本t检验比较两组样本的平均数，比较三组以上的平均数采用单方向方差分析（One-Way ANOVA），多重比较采用Bonferroni分析。两个独立样本率的比较采用2×2表格的卡方检验，而多个样本率的比较采用R×C表资料的卡方检验。用配对计数资料的κ系数分析自身抗体诊断与病理诊断的吻合情况。描绘每个自身抗体的ROC曲线，以曲线下面积评价其对肺癌的价值，比较两个曲线下面积采用z值检验：Z=（Az1-Az2）/√S1E1+S2E2。 利用logistic回归方程建立双正态模型ROC曲线。所有统计采用SPSS13．0处理，检验水准为α=0．05。 研究结果: 1．利用10个人体组织的总RNA进行逆转录反应，从中扩增出了UCHL1、ERBB2、TP53、MYC、BIRC5、YWHAQ、KRT18、BIRC7、IGF2BP1、ANXA1、IGF2BP2、VIL1、IGF2BP3、ENO1、KRT19、ANXA2、CCNB1和FASLG等18个人类TAAs编码基因；构建了这18个基因的无细胞表达克隆，全部基因都能够在RTS Wheat Germ CECF表达出相应的可溶性蛋白；并优化了麦胚无细胞体系表达操作His标签蛋白的纯化条件。 2．精选可溶性的10个重组TAAs纯化蛋白P53、C-myc、14-3-3θ、annexinⅠ、survivin、livin、IGF2BP3、enolase1、annexinⅡ和cyclinB1，通过ELISA间接法，分别检测了144例初治肺癌患者、50例健康者和45例胸部结核等良性疾病患者的血清，发现了相应的10个自身抗体，良性疾病患者的C-myc、survivin、livin和IGF2BP3四个自身抗体的ODavg（average optical density，平均光密度值）分别显著高于健康者，P值<0．05。 3．除IGF2BP3抗体外，肺癌患者其余9个抗体的阳性率显著高于对照者，P<0．05，阳性率范围在10．4%（IGF2BP3抗体）～82．6%（P53抗体）之间；各抗体阳性率与性别、年龄和吸烟量无关，P>0．05；除enolase1和cyclinB1抗体外，其余抗体阳性率与病理亚型无关，P>0．05。除enolase1抗体外，其余抗体阳性率与分期无关，P>0．05。 4．各抗体的敏感性、特异性和准确性分别在10．4%～82．6%、91．6%～98．9%和42．7%～88．3%范围之间，最佳者为P53抗体，最差者是IGF2BP3抗体。 5．只有P53抗体与病理诊断达到较强吻合（吻合系数κ为0．765，P<0．05），大部分抗体吻合度一般（吻合系数κ为0．403～0．624，P<0．05），最弱者为IGF2BP3抗体（κ为0．016，P>0．05）；各抗体κ分别与病理亚型或分期无关，P>0．05。 6．ROC曲线AUC超过0．9的P53（0．965）、survivin（0．925）和enolase1（AUC0．917）三个抗体诊断价值较大，P<0．05；其中P53抗体诊断价值显著高于survivin抗体或enolase1抗体，P<0．05； survivin抗体与enolase1抗体诊断价值无显著性差别，P>0．05。IGF2BP3抗体诊断价值最差（AUC0．016）；其余6个抗体AUC在0．8～0．9之间，P<0．05，具有中等的诊断价值。 初步结论: 1．利用扁桃体、肺、肝、肾、小肠、睾丸、卵巢、脾、心脏和胰腺等10个人体组织的总RNA进行逆转录反应，扩增了UCHL1、ERBB2、TP53、MYC、BIRC5、YWHAQ、KRT18、BIRC7、IGF2BP1、ANXA1、IGF2BP2、VIL1、IGF2BP3、ENO1、KRT19、ANXA2、CCNB1和FASLG等18个编码人类肿瘤相关抗原（TAAs）的基因并构建基因的无细胞表达克隆；TAAs基因能够在麦胚连续交换无细胞快速蛋白质翻译系统（RTS Wheat Germ CECF）表达出相应的可溶性纯化蛋白。Ca2+作为螯合金属离子优化了RTS Wheat Germ CECF操作His标签蛋白的纯化条件。 2．利用RTS Wheat Germ CECF表达出TP53、MYC、YWHAQ、ANXA1、BIRC5、BIRC7、IGF2BP3、ENO1、ANXA2、CCNB1等10个基因相应的P53、C-myc、14-3-3θ、annexinⅠ、survivin、livin、IGF2BP3、enolasel、annexinⅡ和cyclinB1等10个可溶性重组蛋白作为TAAs，通过ELISA间接法，可以检出初治肺癌患者血清的自身抗体，这些自身抗体单独或联合应用，对肺癌有一定的诊断作用。 3．可以选择健康者血清自身抗体ODavg+3D或ODavg+2D作为诊断肺癌的截断值，从阳性率、敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值和吻合系数κ等指标来看，ODavg+2D更佳，但两者无显著性差异。 4．P53抗体为最佳，其敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值和吻合系数κ分别是82．6%、96．8%、88．3%、97．5%、78．6%和0．765。 5．ROC曲线AUC超过0．9的P53（0．965）、survivin（0．925）和enolase1（0．917）三个抗体诊断价值较大，其中P53抗体诊断价值显著高于survivin抗体或enolase1抗体，但survivin抗体和enolase1抗体没有显著性差异。 6．P53、C-myc、14-3-3θ、annexinⅠ、survivin和livin等6个抗体组合为最佳，敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值和吻合系数κ分别达到93．1%、85．3%、90．0%、90．5%、89．0%和0．789。 7． logistic回归与ROC联合分析检验显示，用p53、annexinⅠ、livin和enolase1等4个抗体联合预测肺癌发生的诊断价值最高（AUC0．982、敏感性93．8%和特异性93．7%），回归方程为：Lβ（Y）=YP53-1．01Y annexinⅠ+0．44Y livin+0．76Y enolase1。 8．RTS Wheat Germ CECF是真核表达，具有快速、操作方便、适合于多个蛋白表达的平行操作等特点，而且可确保适当的翻译后加工，保留了蛋白的抗原性。 9．本研究的创新性在于：Ca2+作为螯合金属离子优化了RTS Wheat Germ CECF操作His标签蛋白的纯化条件；开拓了“检索文献方法优选TAAs基因并获得编码序列→RTS Wheat Germ CECF表达出可溶性的重组TAAs蛋白→ELISA间接法检测血清自身抗体诊断肺癌”新诊断模式。发现了诊断价值较高的P53、survivin和enolase1等3个抗体和由p53、annexinⅠ、livin和enolase1等4个抗体组成的抗体谱。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词表

声明

前言

第一部分基因克隆与麦胚无细胞表达纯化

1材料与方法

2 结果

3讨论

4 附录

第二部分 用抗原检测初治肺癌患者血清的自身抗体

1材料与方法

2结果

3讨论

结论

参考文献

攻读学位期间研究成果

致谢

统计学证明