胰岛素生长因子Ⅱ基因印迹丢失在大肠息肉癌变中的意义

摘要

大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈上升趋势，本病早期诊断率不高，临床手术术后5年生存率较低。绝大多数大肠癌发生于大肠腺瘤。目前对于腺瘤癌变的分子机制并不十分清楚，研究主要涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的灭活。近年来肿瘤的表观遗传学改变逐渐受到关注，其中对胰岛素生长因子Ⅱ基因印迹丢失的研究开始受到重视。 基因组印迹和印迹丢失都属于DNA表观遗传（学）的范畴，它不涉及DNA序列的变化，只是针对基因功能的改变，这种变化可以通过体细胞的有丝分裂或性细胞的成熟分裂而遗传。基因组印迹是指配子或合子中的某些基因经过表观修饰后产生的并在后代体细胞不同亲本来源的等位基因差异性表达现象。其中父（母）源等位基因不表达者称为父（母）源印迹。具有这种现象的基因被称为印迹基因。印迹丢失则是指特定亲本来源的等位基因的正常表达方式的丧失。 IGF-Ⅱ印迹基因发现于几个不同实验室对Wilms’肿瘤和贝-威二氏综合征的研究，在小鼠和人类中IGF-Ⅱ基因都是父系等位基因表达，母系等位基因印迹。IGF-Ⅱ的印迹丢失可以导致IGF-Ⅱ表达量的增加，IGF-Ⅱ已被认为是许多肿瘤重要的自分泌生长因子，其过度表达已被证实有促进细胞增殖、恶性转化的作用。研究已经证实了IGF-Ⅱ印迹丢失与肿瘤密切相关且是肿瘤发生的早期事件。但大多数研究不能分析IGF-Ⅱ基因印迹丢失在肿瘤发生的某一发展阶段的相关性，来预测个体患癌的可能；在对人类结肠多发性腺瘤性息肉病的动物模型小鼠的研究中发现，促进IGF-Ⅱ过表达可致结肠腺瘤数量增加，体积增大，并促进了腺瘤的恶性转化，而通过父源IGF-Ⅱ基因敲除降低IGF-Ⅱ的产量后发现，腺瘤的数目和体积都有所减少。但具体在人息肉癌变过程中，IGF-Ⅱ基因印迹丢失是否有作用，还有待进一步研究和证实。 目的: 检测IGF-Ⅱ在正常大肠黏膜、增生性息肉、大肠腺瘤和大肠腺癌中的表达情况，了解IGF-Ⅱ在大肠息肉癌变中的作用；然后分析四组大肠组织中IGF-Ⅱ基因印迹状态，初步探讨IGF-Ⅱ基因印迹丢失在大肠息肉癌变中的可能作用；最后测定上述四组相应患者血清中的IGF-Ⅱ含量，了解其变化与腺瘤癌变的关系；同时了解IGF-Ⅱ基因印迹丢失与IGF-Ⅱ蛋白表达及血清中IGF-Ⅱ含量的关系，为大肠肿瘤的发生发展机制及其预防和早期诊断提供理论依据和研究资料。 材料和方法: 1.实验材料：20例正常大肠黏膜组织、20例增生性息肉、53例大肠腺瘤和24例大肠腺癌组织标本于2007年9月～2008年4月收集于广州南方医院消化内镜中心和普外科；另外16例大肠腺癌于同时间收集于四川川北医学院附属医院。每份组织标本留3份，一份经福尔马林固定，常规石蜡包埋；余两份随即放至低温RNA样本保存液中，并在-80℃保存待行实验。所有患者均是首次行结肠镜检查或住院行息肉切除术或手术治疗，之前均未行治疗。 对上述相应患者（16例四川川北医学院附属医院的大肠癌患者未留取血液标本），同时抽取外周血3ml（空腹），常规离心分离血清，-80℃保存待用。 2.二步法免疫组织化学方法检测20例正常大肠黏膜组织、20例增生性息肉、53例大肠腺瘤和40例大肠腺癌中IGF-Ⅱ的表达情况； 3.PCR-RFLP分析四组大肠组织的IGF-Ⅱ基因多态性，筛选杂合子； 4.RT-PCR-RFLP分析四组大肠组织的IGF-Ⅱ基因印迹状态，了解其IGF-Ⅱ基因印迹丢失情况； 5.放射免疫法（RIA）检测血清中的IGF-Ⅱ； 6.统计学处理：应用SPSS13.0处理数据，免疫组化结果、PCR-RFLP结果、RT-PCR-RFLP结果为计量资料，均用X2检验及Fisher's精确检验；RIA结果为计量资料，以x±s表示，组间比较用方差分析，方差齐时多重比较用LSD法，方差不齐时多重比较用Dunnett'sT3法，以P<0.05表示差别有统计学意义。 结果: 1.133例大肠组织标本中，IGF-Ⅱ的阳性表达主要定位于细胞浆，大肠腺癌和腺瘤组织中IGF-Ⅱ的阳性表达率均高于增生性息肉和正常大肠组织（x2=27.369，P<0.01）； 2.53例腺瘤中IGF-Ⅱ表达与患者年龄、性别、病变部位无明显相关性（P>0.05）；但随腺瘤增生程度的加重而呈增高趋势，表现为轻度不典型增生<中度不典型增生<重度不典型增生，但其变化趋势无显著差异（X2=2.108，P>0.05）；家族性腺瘤（FA）和大肠侧向发育型肿瘤（LST）中IGF-Ⅱ阳性表达率均要高于在普通腺瘤（AP）中的阳性率（X2=6.478，P<0.05）； 3.20例正常大肠粘膜中，有8例的IGF-Ⅱ基因呈ApaⅠ酶切位点的杂合状态（杂合子，40%）；而增生性息肉、大肠腺瘤和大肠腺癌中杂合子分别为45%（9/20）、60.4%（32/53）和62.5%（25/40），各组的IGF-Ⅱ基因多态性无显著差异（#=4.144，P>0.05）； 4.在8例呈ApaI酶切位点的杂合子正常大肠组织中，仅有1例发生IGF-Ⅱ基因印迹丢失（LOI，12.5%），而9例杂合子增生性息肉、32例杂合子大肠腺瘤及25例杂合子大肠腺癌则有22.2%（2/9）、68.8%（22/32）和72.0%（18/25）发生了印迹丢失，腺瘤和腺癌发生IGF-Ⅱ基因印迹丢失的机率明显增高（X2=15.068，P<0.01）； 5.在32例杂合子腺瘤中，IGF-Ⅱ基因在普通腺瘤和LST中的印迹丢失率低于FAP，但三者相比较，并无显著差异（X2=2.695，P>0.05）； 6.正常健康人和增生性息肉患者血清中IGF-Ⅱ水平无显著差异（P>0.05）；而腺瘤和腺癌患者血清中IGF-Ⅱ水平明显高于其他患者（P<0.05）。 结论: 1.IGF-Ⅱ在大肠腺瘤和大肠腺癌组织中过表达，而在正常大肠黏膜和增生性息肉中低表达或不表达； 2.IGF-Ⅱ的过表达可能促使腺瘤的形成和细胞的恶性转化； 3.大肠组织中IGF-Ⅱ的基因多态性无明显差异； 4.IGF-Ⅱ基因印迹丢失在大肠腺瘤的发生及向腺癌的演变中起重要作用，可能是大肠肿瘤发生的又一机制； 5.腺瘤和腺癌患者血清中IGF-Ⅱ含量的明显增高可能与其恶性潜能相关； 6.在腺瘤和腺癌中，IGF-Ⅱ表达增高可能与IGF-Ⅱ的LOI有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写词对照表

声明

前 言

引言

1材料和方法

1.1主要实验材料、试剂和仪器

1.2实验分组

1.3技术路线

1.4实验方法

2结果

2.1IGF-Ⅱ的免疫组化结果

2.2 IGF-Ⅱ的基因多态性及印迹状态分析结果

2.3血清IGF-Ⅱ的放射免疫分析结果

3讨论

全文小结

参考文献

攻读学位期间成果(论文发表)

致 谢

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