模拟微重力对大鼠骨髓间充质干细胞定向成骨诱导分化的影响

摘要

中国载人航天器“神州七号”的圆满成功实现了中国太空行走的伟大梦想。而下一个目标是在太空建立空间实验室，让科研人员长期驻守在空间实验室内进行科研，这就对我国航天医学的发展提出了更加严峻的要求。大量研究表明，当航天员进入空间失重环境后会出现失重性骨质丢失，主要表现为骨量减少，骨矿度降低，粪钙及尿钙排出增多，血钙升高，出现负钙平衡，导致骨密度下降和骨质疏松（osteoporosis），最终使骨力学性能下降，骨折风险增高。航天观察与地面模拟实验结果均显示失重或模拟失重能导致人和动物的持续骨质丢失，研究表明太空飞行导致骨密度每个月约下降2%，相当于一个妇女绝经后1年的骨质丢失量。这种骨质丢失在航天飞行中呈进行性改变，中长期飞行会严重影响骨骼的结构和功能。航天活动中失重造成的骨矿盐的持续丢失导致严重的骨质疏松对宇航员的健康构成了极大的威胁，成为人类长期停留太空和进行星际探索的主要障碍之一。因此，对失重状态下骨量减少的机理研究及如何预防失重骨质丢失一直是航天医学研究的重点和热点。成骨细胞是骨组织中最重要的力学感受细胞和成骨效应细胞，目前大量研究已证实，失重和模拟失重导致的骨质丢失是一个以骨形成抑制起主导作用的过程，以成骨细胞数量下降、骨矿形成障碍和骨成熟延迟为特征。由于微重力下成骨细胞缺乏必要的机械应力刺激，使其增殖和分化功能下降，导致成熟成骨细胞数量下降，骨形成减少，这是造成空间骨丢失的主要原因。而成骨细胞是由骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）在体内的各种调控因素的调节下发展而来。骨形成包括BMSCs分化为成骨细胞和成骨细胞成熟为骨细胞两个过程。因此深入研究成骨细胞以及BMSCs在失重性骨质丢失中的作用具有非常重要的意义。目前关于失重性骨质丢失的研究焦点和热点主要是成骨细胞对微重力的响应、信号传导、基因表达和功能变化及微重力对成骨细胞整个分化过程的影响。关于微重力对BMSCs超微结构的影响报道甚少。 目的： 1.观察在一定诱导条件下，体外分离培养的大鼠BMSCs向成骨细胞的定向分化情况。熟悉并掌握细胞培养技术，为下一步实验奠定基础。 2.探讨模拟微重力对大鼠BMSCs成骨分化过程中碱性磷酸酶（ALP）活性及细胞超微结构的影响。 方法： 1.大鼠BMSCs向成骨细胞的定向分化的验证：采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法分离大鼠BMSCs，将分离纯化的大鼠BMSCs传代培养后随机分成2组，实验组用含抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松联合诱导液的培养基培养，对照组用未含诱导液的普通培养基培养。 2.使用旋转细胞培养系统（RCCS）中50ml容积的高截面纵横比容器（High Aspect Ratio Vessel，HARV）模拟微重力，并结合Cytodex-3微载体进行大鼠BMSCs成骨诱导培养，观察模拟微重力状态下大鼠BMSCs定向成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）活性及细胞超微结构的改变。 结果： 1、原代大鼠BMSCs接种后4d，可观察到成纤维细胞样的细胞集落，9至12d长满单层培养瓶底，传代细胞4至7d长满单层；大鼠BMSCs向成骨细胞定向诱导10天后，诱导组大鼠BMSCs ALP活性（13.016±2.423）明显高于对照组ALP活性（0.675±0.103），差异有统计学意义（P=0.002）。连续成骨诱导20 d后，可见多个散在分布的圆形不透明钙化结节，经茜素红染色后矿化结节呈红色，而对照组细胞融合成片，未见矿化结节沉积。说明在一定诱导条件下大鼠BMSCs能向成骨细胞定向分化。 2、RCCS中模拟微重力状态下经成骨诱导液诱导10天后大鼠BMSCs ALP活性（0.724±0.089）明显低于正常重力对照组ALP活性（13.167±2.550），差异有统计学意义[P=0.002]。模拟微重力组透射电镜下可见部分细胞出现凋亡的细胞学形态改变，部分细胞核呈不规则形，有1-2个核仁，胞质内含有丰富的细胞器，未见细胞胶原纤维以及钙化基质。对照组细胞胞浆丰富，粗面内质网和高尔基器发达，核浆比例小，存在异染色质，明显具有成熟细胞的表现；细胞外基质中出现排列规律的胶原纤维以及初期的钙化、成熟的钙化基质等几种状态，外基质中出现排列规律的胶原纤维以及初期的钙化、成熟的钙化基质等几种状态。说明模拟微重力能诱导大鼠BMSCs的凋亡并抑制其向成骨细胞的分化。 结论： 1、分离纯化的大鼠BMSCs在一定条件下能向成骨细胞定向分化； 2、模拟微重力状态下能诱导大鼠BMSCs的凋亡并抑制其向成骨细胞的分化。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

实验材料

实验方法

结 果

讨论

附 图

第二部分 模拟微重力对大鼠骨髓间充质干细胞定向成骨诱导分化影响的相关研究

材料和方法

结 果

讨论

附 图

总 结

参考文献

附录1.缩略词表

成 果 学习期间完成的与本课题相关的论文

综述 间充质干细胞的研究进展

致谢