MSCs在受体体内的分布及对不相合小鼠allo-HSCT后GVHD及GVT影响的实验研究

摘要

一、研究背景和目的 异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是目前治疗各种造血系统及非造血系统肿瘤、再生障碍性贫血、自身免疫性疾病及某些遗传性疾病的主要和有效手段。allo-HSCT的效果、预后、移植后患者的无病生存率、长期生存率及生活质量取决于患者移植后免疫系统的重建情况、移植物抗宿主病（GVHD）的发生和程度、移植物抗肿瘤（GVT）效应及继发感染等。其中，GVHD发生情况和患者移植后免疫系统重建情况，包括免疫缺陷的程度、持续时间及是否发生继发性感染等，是影响allo-HSCT效果及预后的关键。移植后GVHD及免疫重建延迟或GVT效应削弱等导致的感染、肿瘤复发以及第二肿瘤发生是allo-HSCT后的主要并发症和致死原因，严重影响患者移植后长期生存率和生活质量。因此，降低移植后GVHD发生率、减轻GVHD严重程度、提高GVT效应、减少免疫缺陷持续时间、减轻免疫缺陷程度及加速免疫系统重建是提高患者移植后长期生存率和生存质量的重要方法和手段。 间充质干细胞（MSCs）是一种具有多分化潜能的非造血干细胞，广泛分布于骨髓、脐血、脂肪等组织中。MSCs表面低表达MHC-Ⅰ，不表达MHC-Ⅱ和共刺激分子CD40、CD40L、B7-1、B7-2，同时能逃避同种异基因T淋巴细胞的识别，提示MSCs具有弱免疫原性，能抑制T、B、NK、DC细胞的功能，通过各种途径释放细胞因子或通过细胞间直接或（和）间接作用，诱导免疫耐受。MSCs因具有多器官归巢、优先定位于受损伤靶器官、参与细胞分化及免疫调节等特点，已被广泛应用于allo-HSCT后GVHD的预防与治疗、器官移植后排斥反应的预防以及组织工程及各种自身免疫性疾病的治疗等方面。照射、化疗、免疫抑制剂等因素被认为能够促进MSCs的归巢以及向组织特异性细胞的分化，但具体机制尚不清楚。目前有关受体免疫功能是否影响MSCs在体内植入的研究较少。本实验以同基因小鼠及裸鼠模型为基础，经尾静脉输注MSCs，应用实时定量PCR法定期追踪体内Y染色体标记MSCs，分别观察供体细胞在各受鼠体内的分布与定居情况，有助于我们了解MSCs是否在正常与免疫缺陷受体中的分布、定居及迁移方面存在差异，为MSCs移植安全性的评价提供前期实验的研究基础。 现时预防及治疗GVHD的措施主要是大量应用细胞毒药物及免疫抑制剂，虽然可有效降低GVHD的发生，但同时也削弱GVT效应，加重移植后患者的免疫缺陷程度，使移植后感染及肿瘤复发率明显提高。如何建立特异性免疫耐受减轻GVHD同时保留GVT效应，是改善allo-HSCT效果亟待解决的问题，也是移植免疫学所面临的难题。近年来，越来越多的研究表明MSCs在造血支持及免疫调节方面发挥着重要作用，提示MSCs可能在减轻GVHD反应同时增强GVT效应中扮演重要的角色，是应用前景最为广阔的种子细胞。本研究另外构建小鼠MHC不相合allo-HSCT荷瘤动物模型，将第三方KM小鼠骨髓MSCs经体外培养后与近交系C57BL/6小鼠的脾脏及骨髓细胞共移植，探讨第三方来源MSCs在促进MHC不相合allo-HSCT后免疫重建、诱导免疫耐受的同时对GVT效应的影响。 二、研究方法 1.构建同基因小鼠及裸鼠模型 2.实验分组：分别于输注MSCs后24h、72h、1w、2w及1w、2w、4w、6w分批处死雌性BALB/c同基因小鼠及裸鼠（5只/批），并依次留取肺脏、肝脏、脾脏、结肠、胸腺及骨髓组织。 3.实时定量PCR（SYBR Green法）检测各组受鼠器官组织SRY基因相对表达水平 4.构建小鼠MHC不相合allo-HSCT荷瘤动物模型 5.实验分组：实验分7组，分别为低剂量第三方MSCs移植组（A组），中剂量第三方MSCs移植组（B组），高剂量第三方MSCs移植组（C组），高剂量供鼠MSCs移植对照组（D组），单纯allo-HSCT组（E组），B16+TBI对照组（F组），B16成瘤对照组（G组）。 6、造血重建标准：外周血白细胞计数（WBC）>1．0×109/L为造血重建指标，并通过嵌合体检测证实骨髓植入成功。 7.嵌合体检测：PCR扩增外周血基因组Y染色体基因 8.aGVHD表现与评分标准：aGVHD判断通过观察：体重变化、食欲、精神状态，活动能力，皮肤黏膜，腹泻等情况，并计算平均生存时间；另取濒死受鼠皮肤、肝脏、小肠等组织进行病理学检查。 9.流式细胞仪（FACS）检测外周血T淋巴细胞亚群：于骨髓移植后+7d开始，每周每组取3～4只受鼠行FACS检测外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+CD25+比例变化。 10.外周血上清细胞因子lFN-γ、IL-2、IL-4及TGF-β检测：移植后+14d采用ELISA方法进行检测。 11.移植动物成瘤情况观察：肿瘤导致死亡判断标准：动物死亡时WBC）1．5×109/L，肿瘤明显增大，甚至破溃坏死，无明显aGVHD临床表现。待出现可触及的肿块时记为肿瘤出现时间，用游标千分尺测量肿瘤的最长直径（L）和与其垂直的最大横径（W），以后每3d测量1次，直至肿瘤出现破溃或小鼠死亡。 12.统计学分析：实验数据采用SPSS13．0统计软件包进行处理。结果用均数±标准差（x±SD）表示，采用析因方差分析分别对不同时间段的同基因小鼠及裸鼠的肺脏、肝脏、脾脏、结肠、胸腺、外周血及骨髓等脏器组织的SRY基因表达变化差异进行统计分析，多组间比较采用One-way ANOVA进行统计分析，移植后外周血淋巴细胞亚群变化采用重复测量统计分析，组间比较采用LSD或Dunnett's T3多重比较法。一个因变量与多个自变量间的线性数量关系用linear regression进行逐步回归统计分析。P<0．05为差异有统计学意义。并对小鼠生存时间进行Kaplan-Meier生存模型分析，绘制生存时间曲线。缺失数据：预处理后存活时间少于5d视为移植失败，不作统计。 三、结论 1.MSCs输注安全，未发现有毒副作用。 2.MSCs在正常与免疫缺陷或致死量照射的同种异体中的分布、定居及迁移方面存在差异，其植入细胞量及时间与受体免疫功能密切相关。 3.第三方或供者来源MSCs均可促进MHC不相合allo-HSCT后造血及T细胞亚群重建，作用效果与MSCs数量呈正相关但与MSCs来源无关。 4.第三方或供者来源MSCs均可减轻MHC不相合allo-HSCT后aGVHD症状，受鼠GVHD发生时间显著推迟，且生存时间明显延长，其作用效果与MSCs数量有关，与MSCs来源无关。 5.第三方或供者来源MSCs在减轻MHC不相合allo-HSCT后aGVHD的同时，对GVT的抑制作用不明显。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分骨髓间充质干细胞输注在受体体内的分布研究

前 言

第一章 材料与方法

1.1材料

1.2方法

1.3统计学处理

第二章 实验结果

2.1MSCs的分离、培养及鉴定

2.2移植模型建立

2.3同基因小鼠及裸鼠不同时间段各脏器组织SRY基因表达水平

第三章 讨论

参考文献

第二部分第三方骨髓间充质干细胞对MHC不相合小鼠造血干细胞移植后GVHD及GVT影响的实验研究

前言

第一章 材料与方法

1.1材料

1.2方法

1.3造血重建

1.4 aGVHD的判断

1.5流式细胞仪(FACS)检测外周血T淋巴细胞亚群

1.6外周血上清细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4及TGF-β检测

1.7移植动物成瘤情况观察

1.8统计学处理

第二章 实验结果

2.1供鼠MSCs的分离、培养及鉴定

2.2模型建立

2.3造血重建

2.4移植后各组小鼠aGVHD的观察

2.5各组受鼠生存时间

2.6外周血T淋巴细胞亚群

2.7外周血上清细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4及TGF-β水平

2.8 MSCs对小鼠移植后肿瘤生长的影响

第三章 讨论

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

统计学审稿证明