大鼠脂肪基质细胞的分离培养及二步法诱导分化为神经细胞的实验研究

摘要

成体脂肪基质细胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs）是一类存在于脂肪组织中、具有多向分化潜能的干细胞，研究发现，它具有几乎和胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）一样具有较强的分化潜能，在一定诱导条件下，既可以向中胚层起源的成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞和脂肪细胞分化，也可以向外胚层起源的神经细胞分化，且至今为止尚未发现致瘤性。因其来源丰富且易于取材，将可弥补胚胎组织来源和成体中枢来源神经干细胞（neural stem cells，NSCs）在应用上的困难如来源不足、采集困难、免疫排斥、法律伦理限制等，显现了在中枢神经系统（central nerve system，CNS）疾病细胞移植治疗领域的巨大潜能。本课题以大鼠ADSCs为研究对象，主要从ADSCs的分离培养和向神经细胞定向诱导分化的方法学上进行研究，探讨建立一种简便高效的由成体ADSCs在体外诱导培养获得NSCs的方法，以期优化成体ADSCs诱导分化实验流程、提高定向分化比例，从而解决NSCs移植的种子细胞来源不足、体外定向分化率低等问题，为细胞移植治疗CNS疾病的临床应用提供实验基础。 第一部分：大鼠ADSCs的体外培养扩增及其生物学特性的观察。 目的：分离、纯化、体外培养扩增大鼠ADSCs，并观察其生物学特性。 方法：无菌麻醉状态下取SD大鼠的腹膜后脂肪组织，用剪刀剪碎并以Ⅰ型胶原酶消化离心，以含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中培养并传代，CK2型倒置光学相差显微镜下追踪观察活细胞培养生长情况并拍照；四唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞生长增殖情况，绘制细胞生长曲线；流式细胞仪检测及免疫荧光细胞化学染色（间接法）检测CD34、CD106、CD44、HLA-1等细胞表面标志。 结果：倒置显微镜下观察，刚接种的细胞大多呈圆球状，悬浮在培养基中，可见少数脂滴悬在最上层；ADSCs原代有多种形态，有圆球状、长梭形及成纤维样。通过贴壁传代法除去杂细胞，传至第五代，细胞形态较为一致，呈长梭形，细胞排列整齐，有漩涡状特征；在10％胎牛血清存在的条件下，传代细胞每24h增殖1倍，并表达较强的CD44免疫细胞化学阳性染色。流式细胞仪检测细胞表面标记表达率分别为CD340.8％，CD10613.6％，CD4499.7％，HLA-196.7％，符合ADSCs的表型特征。 结论：所采用的细胞分离培养方法简便可行，所获得的ADSCs纯度较高，细胞活力旺盛，自我更新能力强。 第二部分：大鼠ADSCs向神经细胞的二步法诱导分化。 目的：探索以“ADSCs→神经（干细胞）球（第一步）→神经组织细胞（第二步）”的二步法诱导大鼠ADSCs向神经细胞定向分化的方法。 方法：取第五代培养细胞进行诱导分化：无血清Neurobasal培养基联合应用碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）20ng/ml、表皮生长因子（epithelial growth factor，EGF）20ng/ml和N2（1：100）添加剂，将细胞先诱导成神经球，当形成的神经球达到15～20个/低倍视野时，机械法轻柔吹打神经球使之离散，再以Neurobasal培养基重悬细胞，按1：3比例进行传代。取第二代神经球加入1％胎牛血清、5％马血清、0.5μmol/L的维甲酸（retinoic acid，RA）和50ng/mL（brain-derived neurotrophic factor，BDNF），促进其向神经元和胶质细胞方向分化。免疫细胞化学检测巢蛋白（Nestin）、微管联合蛋白2（MAP2）、β-神经微管蛋白（β-tubulinⅢ）、神经胶质纤维酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）及半乳糖苷酶（Galactocerebroside，GalC）等标志性蛋白的表达情况。荧光显微镜下观察细胞形态、拍照记录，并进行阳性细胞记数，扫描电镜下观察分化细胞的表面形貌。 结果：传代纯化后的ADSCs贴壁生长，呈梭形，增殖旺盛，几乎不表达NSCs标志性蛋白Nestin。无血清Neurobasal培养基诱导第3～4天时，细胞开始向中央聚集，形成多个克隆团，第5～7天时，可见许多小的悬浮的神经球出现。神经球迅速增殖，14天的直径可达100um。神经球样结构在添加了血清及神经营养物的Neurobasal培养基中逐渐展开并呈贴壁生长，细胞形态各异，生长旺盛。于诱导培养后的第4～5天开始，部分呈现典型的神经元样改变。扫描电镜下观察ADSCs在未分化状态下，细胞呈扁平成纤维样，细胞表面分泌物不多；ADSCs分化为神经元后，细胞立体感增强，细胞胞体变得梭长，并发出突起，胞体表面分泌物增多。免疫荧光染色显示神经球高度表达NSCs标志性蛋白Nestin；自神经球诱导分化而来的细胞大部分呈β-tubulinⅢ（早期神经元标志性蛋白）、MAP2（成熟神经元标志性蛋白）阳性表达、有少量表达GFAP（神经胶质细胞标志性蛋白）和GalC（少突胶质细胞标志性蛋白）。 结论：应用本实验方法，以无血清Neurobasal培养基添加N2、bFGF、EGF等作为NSCs增殖培养基，可获得较高比例的克隆形成。将ADSCs诱导成神经球后再进行传代，可稳定表达细胞特性，且在连续传代培养中依旧维持这种克隆能力。光镜及扫描电镜下可见分化细胞呈现典型的神经元样形态，免疫细胞化学证实分化细胞可表达高比率的神经组织细胞特别是神经元的特异性标志，表明了本实验方案的高效性和可行性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:中英文缩略词对照表

声明

前 言

第一部分大鼠脂肪基质细胞的体外培养扩增及其生物学特性观察

一、引言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、小结

六、参考文献

七、附图

第二部分大鼠脂肪基质细胞向神经细胞的二步法诱导分化

一、引言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、小结

六、参考文献

七、 附图

全文结论

综述 脂肪基质细胞体外培养及向神经细胞的定向诱导分化

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致谢

统计学证明