TRPC通道参与U-87细胞缺氧诱导的VEGF表达的研究

摘要

恶性多形性神经胶质细胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM）是最常见的恶性脑部肿瘤。GBM患者通常预后很差，是癌症相关死亡的主要原因。这一类型肿瘤呈现高度血管依赖性。通常，神经胶质瘤恶性程度越高，则血管化程度越高。许多生长因子可以调节肿瘤血管生成，包括：成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factors，FGF），血管内皮生长因子（Vascular endothelia growth factors，VEGF），内皮生长因子（Endothelial growth factors，EGF）和转化生长因子（Transforming growth factors，TGF-β）等。其中，VEGF是最重要的实体瘤血管生成因子。VEGF可促进血管内皮细胞增殖，导致血管生成。缺氧是GBM的显著特征，同时也是一个已知的可诱导VEGF表达的重要因素。人们发现，GBM坏死区周围存在高度缺氧的区域（pseudopalisading region），该区细胞表达高水平的VEGF。 VEGF表达的调节是复杂的，涉及到多个不同的水平，包括：VEGF转录增加，VEGF mRNA的稳定，VEGF蛋白的分泌和扩散。在大多数细胞，缺氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor，HIF-1α）是调节VEGF表达的关键转录因子。缺氧情况下，HIF-1α蛋白增加且转录活性升高。它与HIF-1β形成异源二聚体，与VEGF启动子区结合，介导VEGF表达。 通常，转录因子直接调控下游靶基因表达。然而，离子通道可能在更上游的水平发挥调节基因表达的作用。嗜铬细胞瘤细胞系（PC12）是一个公认的可兴奋的氧感受细胞；缺氧可以抑制氧敏感的钾离子通道（Kvl.2），细胞因此产生去极化；Kvl.2的失活过程密切耦联于HIF-1靶基因酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase）的表达。此外，非选择性阳离子通道（non-selective cation channels）也参与缺氧信号转导通路。严重缺氧联合葡萄糖剥夺（prolonged oxygen and glucose deprivation）激活TRPM7-ROS正反馈通路，介导钙超载事件，引起神经元坏死。中等程度缺氧（1%）条件下，Yamaji等发现非选择性阳离子通道参与缺氧诱导的内皮细胞糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达。缺氧暴露时，非选择性阳离子通道被激活，通透钙离子导致星形胶质细胞胞内钙浓度升高，而钙是重要的基因表达的调节者。 本研究主要关注TRPC离子通道。TRPC通道是一个重要的TRP通道成员，可以感受多样性的外界刺激。人类细胞表达六个TRPC亚型（TRPC1-7），除了TRPC2（在人类是假基因）。通过联合使用药理学以及细胞分子生物学方法，我们确认了一个特异性的TRPC亚型，TRPC1，参与缺氧诱导的U-87细胞VEGF表达。 目的: 本研究联合使用多种细胞生物学和分子生物学方法：MTT，hoechst染色，real-time RT-PCR，western blot，免疫荧光技术，RNA干扰，过表达，钙浓度测定方法等，探讨TRPC在缺氧诱导的U-87细胞VEGF表达中的作用。 方法: 1.通过MTT、Hoechst、western blot和real-time RT-PCR方法，分析低氧（1%O2）不同时间点细胞凋亡、增殖、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）以及VEGF表达情况，以建立神经胶质细胞瘤细胞系U-87体外缺氧诱导VEGF表达的模型。 2.通过real-time RT-PCR，观察TRPC通道阻断剂SKF96365对缺氧诱导的VEGF表达的影响，以确定TRPC通道是否参与缺氧诱导的VEGF表达。 3.采用RT-PCR，检测常氧情况下不同TRPC通道亚型在U-87细胞上的表达情况。 4.使用激光共聚焦显微镜，观察加入TRPC通道激动剂OAG以及阻断剂2-APB时细胞内Ca2+的动态变化，以确定U-87细胞上的TRPC通道是否是功能性的。 5.使用real-time RT-PCR，观察并分析缺氧后TRPC通道各亚型的表达情况，以确定下一步需要使用的分子生物学策略：过表达或RNA干扰。 6.通过RNAi下调TRPC1表达。分别用real-time RT-PCR和ELISA检测VEGF mRNA和蛋白水平的变化，观察下调TRPC1对缺氧诱导的VEGF上调的影响。 7.通过瞬时转染野生型TRPC3或TRPC5质粒增加TRPC3或TRPC5表达。观察TRPC3和TRPC5对缺氧诱导的VEGF表达的影响。 8.通过免疫荧光技术，使用激光共聚焦显微镜观察缺氧是否引起TRPC1胞内转位变化。 结果: 1.Hoechst结果显示：缺氧（1% O2）24h或48h不导致细胞凋亡；缺氧24h仅轻微减少了细胞增殖（下降3.23%），而缺氧48h细胞出现明显的增殖抑制（减少22.35%，P<0.001）；缺氧（1%O2）诱导HIF-1α增加；缺氧10h显著诱导VEGF表达（升高4.24倍，P<0.01）。 2.TRPC通道阻断剂SKF96365可明显抑制缺氧U-87细胞VEGF表达。25μM SKF96365抑制了VEGF mRNA水平的上调（P<0.01），且增加SKF96365的浓度进一步抑制VEGF表达。 3.常氧条件下，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，检测到四个单一条带，大小为168bp，112bp，119bp，159bp（与预期的产物大小一致），分别对应于TRPC1，TRPC3，TRPC4和TRPC5亚型。 4.TRPC通道激动剂OAG可增加胞内Ca2+浓度，而TRPC通道阻断剂2-APB可抑制激动剂诱导的胞内Ca2+浓度增加。 5.缺氧后，U-87细胞TRPC3和TRPC4亚型表达分别减少67.7%，68.2%（P<0.05）。此外，高敏感的荧光定量PCR无法检测到缺氧U-87细胞TRPC5亚型转录本。另一方面，常氧和缺氧胶质瘤细胞TRPC1的表达保持稳定，并不发生明显减少。 6.化学合成的siRNA显示出高度的细胞传输效率（超过90%）；三个TRPC1特异性的siRNAs：siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3分别减少TRPC1 mRNA到64%，39%和36%（P<0.01）；分别减少TRPC1蛋白到阴性对照组的48%，29%和33%（P<0.01）。siRNA-2和siRNA-3显著抑制了缺氧诱导的VEGF基因上调（P<0.01）。同时培养基中分泌的VEGF也发生类似的变化（P<0.01）。 7.通过瞬时过表达TRPC3或TRPC5增加了缺氧情况下U-87细胞TRPC3或TRPC5的表达水平。但过表达这些TRPC野生型质粒DNA既不促进缺氧U-87细胞VEGF表达，也不减弱VEGF表达（P>0.05）。 8.常氧条件下，TRPC1通道分布于胞膜及胞浆。然而缺氧后，胞浆区TRPC1荧光明显减少，而细胞膜出现强烈的荧光信号。 结论: 1.1%O2是人体内实体肿瘤低氧环境的氧气浓度。体外的缺氧实验证实该氧气浓度作用24h不能诱导显著的细胞凋亡且仅轻微抑制细胞增殖，但延长缺氧暴露时间至48h可导致细胞增殖抑制。说明1%O2作用小于24h可能是合适的体外诱导U-87细胞VEGF表达的模型。进一步，缺氧（1%O2）可增加HIF-1α蛋白水平，并显著诱导VEGF上调。 2.TRPC通道阻断剂可抑制缺氧U-87细胞VEGF表达，说明TRPC通道可能参与缺氧诱导的VEGF表达。 3.常氧条件下，U-87细胞共表达四个TRPC通道亚型，分别为：TRPC1，TRPC3，TRPC4和TRPC5。 4.对TRPC通道激动剂和阻断剂的反应性，说明U-87细胞上TRPC通道是功能性的。 5.缺氧后TRPC3，4，5亚型表达量显著减少，而TRPC1表达保持不变。说明相对于其他TRPC亚型，TRPC1可能在胶质瘤细胞缺氧信号通路中扮演不同的角色。并提示下一步针对缺氧抑制表达的TRPC亚型，可采用过表达方法；而针对TRPC1，则采用RNA干扰技术。 6.通过RNAi下调TRPC1表达可抑制缺氧诱导的VEGF基因表达，此外，分泌型VEGF也受到抑制。说明TRPC1参与缺氧诱导的VEGF表达。 7.过表达可显著增加TRPC3或TRPC5亚型表达。但过表达这些TRPC野生型质粒DNA既不促进缺氧U-87细胞VEGF表达，也不减弱VEGF表达。说明TRPC3或TRPC5不参与缺氧诱导的VEGF上调过程。 8.缺氧诱导TRPC1细胞膜转位，说明缺氧条件下，TRPC1可能通过转位而被激活，参与缺氧诱导的VEGF表达。

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